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1、PCR引物设计原理,PCR反应一般由三个步骤组成：模板的热变性；引物复性到单链模板上；热稳定DNA聚合酶催化的延伸,变性,在应用 Taq DNA 聚合酶进行 PCR 时，变性温度在94-95下进行，这也是Taq DNA聚合酶进行30个或30个以上PCR循环而活力不受到过多损失时能耐受的最高温度。有时把变性时间设计为 5min，以便大分子模板 DNA 彻底变性的概率。对于 GC 含量为 55%或更低的线性 DNA 模板，推荐 PCR 的变性条件是 94-95 变性45s。,复性温度（退火温度）至关重要！退火温度太高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率会非常低；退火温度太低，引物将产生非特异性复性
2、，从而导致非特异性DNA片段的扩增；退火温度，通常比理论设计的引物和模板的Tm值低 3-5 下进行。最好通过对复性温度比两条引物的Tm 值低 2-10 内进行PCR预实验（梯度）来对复性条件的优化。,引物和模板DNA 的复性,对 Taq DNA 聚合酶来说，最适温度为72-78，时间约为1min。,引物的延伸与循环数目,哺乳动物 DNA 为模板时，至少进行25个循环才能得到足够量的扩增产物。一般为30-33个循环。,引物设计要点,（1）碱基组成：GC含量应在40%-60%（45%-55%）之间，4中碱基在引物中分配均匀。没有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如AAAAA等，没有二核苷酸重复序列，如GCG
3、CGC等；（2）引物长度：引物中与模板互补的区应为18-25个核苷酸长度，上下引物长度差别不能大于3bp，如上游引物为19bp，下游引物为24bp等。,（3）重复或自身互补序列：形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复性。,（4）上下引物的互补性：一个引物的3末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二聚体。当一个PCR有多对引物时，注意检查任何一个3末端都不能和 其他任何引物互补。,（5）解链温度（Tm 值）：计算出来的两个引物的 Tm 值相差不能大于5，扩增产物的 Tm 值与引物的 Tm 值相差不能大于10；引物的 Tm 值一般为50-70。这些特性保证
4、了扩增产物在每一个 PCR 循环可有效变性。,（6）3末端3末端的性质非常关键。如果可能的话，每个引物的3末端碱基为G或C；最好不要A，或AA等多聚A；但不推荐3末端有.NNNCG或.NNNGC序列的引物，GC高自由能促进发夹及引物二聚体产生。,当末端碱基为 A 时，错配时引发链合成的效率大大降低；当末端碱基为T时，错配情况下亦能引发链的合成，所以一般 PCR 反应中，引物3末端的碱基最好选T、C、G，而不选A。引物3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之
5、间，所以3端最好选择T。？（7）5端序列添加限制性酶切位点：,一些概念,有意链（Sense strand），正义链（positive strand），编码链（coding strand）；无意链（anti-sense strand），负义链（negative strand），模板链（template strand）,正向引物（forward primer）：处于DNA双链上游的引物。如用于测序，则从53方向读出 DNA正链的序列。反向引物（Reverse primer）：处于目的DNA双链下游的引物。如用于测序，则读出 DNA负链从下游到上游的反向序列。,Primer Premier 5.0
6、软件设计引物,是由加拿大的 Premier 公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计、评估的软件主要界面分为序列编辑窗口（genetank）、primer design、酶切分析（restriction site）和 Motif,正向（As is）、反向（reversed）、互补（complemented）及反向互补（reverse complemented）。,正向（As is）,反向（reversed）,互补（complemented）,Enzyme,软件默认以表格方式显示酶切结果。单击Seq 或 Map，分别以序列或图示的方式显示结果。缺点：不能以文本的形式保存结果。,Mot
7、if,Primer,点击 Search，进行引物搜索,Search criteria 窗口：多种参数可以调整。,Primer Length常设置在1830bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。,PCR Product size最好是100500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。,ManualSearch parameters 人工搜索参数设置窗口。,Search stringency应选High。,GC含量一般是4060。,其它参数默认就可以。,Search progress 窗口中显
8、示Search CompletedOK键,结果窗口有三种显示形式，上游引物、下游引物和成对显示。引物按优劣次序排列，满分为100。选其中的一对引物，在主窗口显示结果。,对于上述引物，如果其它各项指标还可以，可在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。,搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。,当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它。,引物3端2个A或T,或引物内部连续的G或C太多，或引物3端2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。,该图分为四部分：最上面是图示模板及产物位置，“S”和“A”可查看有义链或反义链的引物。
9、右边是两个引物在模板上结合位置的直观图；第二层是模板及引物序列的配对情况；第三层显示引物的各种参数。注意：尾末给出该引物的最佳退火温度！第四层：四种重要指标的分析,引物长度：控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火温度。长的PCR引物能给扩增带来更好的特异性，可以通过降低退火温度提高反应的灵敏度，不过长引物易形成包括发夹结构二聚体自身互补等二级结构。适宜引物长度为18-27 nt。,Tm 融链温度：根据相邻二碱基对作用原理来计算融链温度。PCR 反应的合适 Tm 范围为56-63（50-70）,GC%含量：对于PCR 反应来说 GC含量在50%左右比较合适。（40-60%,45-55%）,De
10、generacy多义性，尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异性，尽量避免3末端的多义性，因为这个位置即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。,BLAST 验证引物,点击Basic BLAST中的 nucleotide blast 选项,在Enter Query Sequence栏中输入引物序列：例：引物为5-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3;5-TGCCCATCACAACATCATCT-3同时输入上下游引物。输入上下游引物都从5 3。输入上游引物后，加上20个字母n，再输入下游引物。,在Choose Search Set栏中：Database根据预操作基因的种属定了，可选Human
11、 genomic+transcript或Others,在Program Selection中：选择Somewhat similar sequences(blastn)项，如下图：,在此界面最下面关键要点击Algorithm parameters参数设置，进入参数设置界面。,在General Parameters中：Expect thresshold期望阈值须改为1000，大于1000也可以；在Word size的下拉框将数字改为7。,图中：序列与引物匹配的得分值小于40分、4050分、50-80分、80-200分等，分值越高，特异性越好；线段代表上或下游引物，其颜色和上面对照后就可得出该条引物
12、的分值。两线段间没有连线的，表示单条引物与该基因一致。有连线的代表这些序列与上游引物匹配（Strand=Plus/Plus）、并与下游引物互补（Strand=Plus/Minus），理论上可以扩增出基因片断。点击线段，就能跳转到该基因的结果信息概要。,Accession，数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的信息,Desscription序列的简单描述,高的就是有两线段间有连线的,代表随机匹配的可能性。E值接近零时最有意义，也就是说序列完全匹配了。,比对到的序列长度,E值越小为好！,匹配上的碱基数占总序列长度的比例,缺失或插入，用“-”来表示,Query1、2表示输入的两对引物，Sbjc
13、t表示在库里比对的序列,Primer BLAST的详细结果,ncbi 在线 primer 设计,默认的参数实际上是从100到1000，这个你得自己改，如果你希望产物的大小符合你的预期，尽可能把范围改小，比如480-500,至于RT-PCR所用的引物，最好是使得产物跨过内含子，这样避免潜在DNA对RT-PCR的干扰。,用Oligo软件设计/评估PCR引物,启动Oligo，选择Fileopen，打开要进行引物分析的序列。,图中显示的三个指标：Tm值、G和 Frequencies。,退火温度窗口是设计引物的主窗口，其他两个具有辅助作用。,因为分析要涉及多个指标，启动窗口的Cascade 排列方式不太
14、方便，可从windows菜单改为Tile方式。,用Tile方式显示窗口,Tm，退火温度窗口,Tm值曲线以选取72附近为佳；5到3端的下降性状也有利于引物引发聚合反应。,圈出来的序列部分及黄色的bar即代表当前分析的21个碱基的Tm值,可点击窗口的左下角的Upper、Lower按钮选择上游引物、下游引物。,Tm值似乎太低了,Tm值似乎太高了,显示了装载的整个序列的 6-7 mers寡核苷酸顺序的相对频率。寡核苷酸的3端如果在一个特定的数据库（GenBank的子数据库）更普遍（即出现的频率更高），那么更容易导致错误引发。,Frequencies，碱基频率窗口,如果选择出现频率较低的位点作为3末端，
15、那么就减少了在复杂的底物（比如整个基因组DNA）内的许多位点结合、引发的几率，从而减少了非特异性PCR产物的形成。,平均频率为1000的话，CTTGGC的频率为1500以上，而TTGGCG德频率很低，约300。,G，序列内部碱基稳定性窗口,显示了寡核苷酸的内部稳定性(五聚体的自有能)。,-1.9值=-（3.1+3.1+3.1+1.6）,G值反应了序列与模板的结合强度；最好引物的G值在5端和中间值比较高，而在3端相对低。,在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的，以自由能G表示。,第二个核苷酸,第一个（5）核苷酸,例子：双链d（ACGG/CCGT）的G是：G（ACGG）=G（AC
16、）+G（CG）+G（GG）=-（1.3+3.6+3.1）=-8.0kcol/mol,显示了3末端序列G值较低，适合引发。,3末端序列G太高。,你可以在三个窗口中自行设计引物。,选择了自己认为顺眼的位置，此时，点击Uper，上游引物即可显示。,同时在序列下游寻找下游引物，点击Lower，即可显示下游引物。,对你设计的引物质量进一步分析。,同时在序列下游寻找下游引物，点击Lower，即可显示下游引物。,参数设置与搜索选择searchfor primers and probes，进行如右图设置。点击search ranges，设置引物范围和 PCR产物的大小点击parameters，进行参数设置。,
17、因为设计的是一对引物，正、负链的复选框都要选上。同时选compatible pairs,默认下，对引物的要求：无二聚体、3高度特异、GC%含量有限定、去除错误引发引物等。,引物的长度及产物的长度设置。,Primer Length设置在1830bp,短了特异性不好，长了没有必要;,PCR Product size最好是100500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊。上限没有太多的限定。,普通设置、参数及更多参数,从高到低六个等级的设定，最后有一个用户定制选项。当对软件功能不了解时，应选very high/High。,选automatically change st
18、ring 后，搜索引物时，如果在高等级设定中无法搜索到引物对时自动降级一个等级来搜索，直到找到为止。,反向引物时用,让引物的长度可以改变，以适应设定的Tm值或PE（prime Efficeince）值（引发效率）。,可以限定所选引物对的最大数目。,实际上需要我们改动的只有引物的长度，根据实验需求做相应改动。,其他的参数就使用Oligo默认值，一般无需改动。,直接使用Oligo默认值，一般也无需改变。,参数设置完毕后，点击确认OK，程序即进行引物搜索。,引物搜索结果如入：Oligo提供了按引物位置、产物大小、退火温度、GC含量等的排列方式。,Oligo最突出的功能不在于引物搜索而在于引物分析。它
19、提供了多种分析方法并以不同的形式展现出来。选择其中的一对引物，这时程序自动弹出一个PCR分析窗口。,PCR,optimal annealing temperature（最佳退火温度）数值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。,产物Tm值与引物Tm值（低的那个）的差异，一般控制在20度以内。,引物间Tm值的差异，一般控制在5-6度以内。,引发效率：上（下）引物对于正、负链正确引发效率比。,最佳引物浓度,在Analyze 菜单中，Oligo 提供了众多分析功能。选择相应的功能，分析结果。,点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息;其中包括引物
20、的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高;引物的Delta G和3端的Delta G:3端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。,Key Info,Duplex formation，引物二聚体,引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素应避免，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其G值应该偏低由退火温度决定，50的退火温度和65对二聚体的影响肯定不一样。,The most stable 3-Dimer Delta G绝对值一般不要超过4.
21、5kcal/mol。G绝对值越大结构越稳定。,结合碱基对不要超过3个。,the most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关。实验表明在PCR退火温度65时，6.7kcal/mol没有问题。,Hairpin formation，引物发夹结构,Delta G绝对值一般不要超过4.5kcal/mol。,结合碱基对不要超过3个。,特定的发夹如果没有显示Tm值，那么发夹结构就不容易形成。,结合碱基对已经超过3个。,在3形成发夹会引发引物内部的延伸反应，减少了参加正式反应引物的数量。,Composition and Tm,上下游引物的GC控制
22、在4060。,最后一种是Primer5所采用的方法。,Td is a normalized Tm in 1M salt conditions,the Tm is a variable value,that depends on salt and DNA concentration set in the Search Parameters window,Tm值高时错配很少，特异性强。,False priming sites，错误引发位点,oligo会给正确引发效率和错误引发效率。,一般的原则：使误引发效率控制在100以下。,有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400500，错误引发效率超过
23、100幅度若不大的话，也可以接受。,Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。,下游引物对于负链，没有发现错误引发。,Selected Oligo,Primer pairs,系统设计出的所有引物对。,internal stability,Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。,引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。,上游引物的参数,注意：必需把方框拉到上游引物处。,对应的下游引物的参数,注意：必需把方框拉到下游引物处。,Hybridization time，杂交时
24、间,该窗口显示了不同长度、不同浓度的寡核苷酸的杂交时间,Concentration,您只需点一下鼠标，就轻松地实现对你地引物、PCR产物、DNA模版链即时的浓度、体积、OD值、分子量的转换。,该浓度窗口是一个强大的时间保存计算器。,Oligo不仅能以图表的方式将结果展示出来，还能以文本的形式保存。在软件所出现的任何一个窗口，选择Filedata As，把数据存为一个文本文件。,文本保存的结果如下：,最佳退火温度,最佳引物浓度、盐浓度,Primer premier 5设计引物Oligo引物评估,举例说明：ncbi里查找基因 LIF 的mRNA序列，用FASTA格式直接保存改基因的CDS区序列。,
25、上游引物,下游引物,可以看出，Oligo对引物进行了非常全面的分析，为选择最佳的引物提供了参考。Oligo不仅能对所搜索的引物进行全面分析，还能对任意的寡核苷酸进行分析。选择Filenew sequence，在出现的窗口中输入要分析的寡核苷酸序列，完毕后按回车键或选择Accept/DiscardAccept。,温馨小提示：当你验证引物时，不要如图似的把引物序列直接黏贴。此处，应该把模板序列输进去。,edit new sequence 里用键盘输入上游引物的模板序列（A），选择Accept/DiscardAccept。输入S或dsDNA是错误的。,注意：看到的序列是模板，而不是需要验证的引物。,
26、看：上游引物已经显示了！,显示的是方框/当前序列的位置,也可以这样操作：方框定位到288，点击Upper，即可显示上游引物。错误！,当方框短于引物时，可改变当前序列长度,下游引物也显示了！,引物序列长度不同于当前的引物，从“Change”菜单中改变当前的引物长度！,引物输入完毕，接下来分析各个参数,上下引物3末端没有二聚体产生。,Primer premier 5,Oligo,上下引物间产生的二聚体，G绝对值应小于4.5值。,Primer premier 5,Oligo,上引物内部形成的二聚体。G绝对值大于9，有点不能接受，而且核苷酸为4个。,Primer premier 5,Oligo,下引物内部形成的二聚体。G绝对值小于4.5，可以接受，最佳退火温度时可以忽略。,Oligo,Primer premier 5,上引物内部形成的发夹结构。G绝对值小于4.5，可以接受。,下引物内部没有形成发夹结构。,False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有分析，但不如oligo详细。,Primer premier 5,注意：此处，引物在非特异位点进行引发，错误引发。,Primer premier 5,上下引物内部稳定性分析,上引物6-mers 出现频率分析,下引物6-mers 出现频率分析,
