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1、PCR技术上岗培训,疾病的诊断,分子诊断,影象学诊断,细胞/组织诊断,临 床 诊 断,免疫诊断,生化诊断,几乎所有的疾病都是基因病,科学研究已证明，基因可以揭示疾病的本质，人类几乎所有疾病都直接或间接与基因有关，在某种意义上都是基因病，,PCR技术,1985年美国人莫里斯（Kary Mullis）发明了一种模拟DNA体内复制过程，在体外复制特定DNA片段的方法，并将其命名为聚合酶链式反应（PolymeraseChain Reaction，PCR）。PCR可以在短时间内倍增极微量DNA（理论上说,仅有一个足够了）至百万或十亿倍，通过PCR可以简便、快速地从微量生物材料中获得大量特定的核酸，并具有
2、很高的灵敏度和特异性，可用于微量核酸样品的检测。,PCR技术,PCR技术被科学界誉为生物技术领域最伟大的发明之一，美国人莫里斯在发明该技术不久就因此于1993年获得诺贝尔化学奖。PCR及其相关技术于80年代末在国外开始应用：欧共体（现欧盟）、日本、美国相继把PCR这一基因诊断核心技术列入献血员筛查，美国食物与药品管理局已批准了60多种基因诊断试剂用于临床，美国国家疾病控制中心已把PCR技术列入疾病诊断的常规技术。,1.DNA变性（90-96）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA2.退火（25-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3.延伸（70-75）：在T
3、aq酶（在72左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。,标准的PCR过程分为三步,荧光PCR检测技术是在传统PCR技术基础上，加入荧光标记的基因探针，通过探针与扩增产物的结合释放出荧光信号，再通过专门的仪器（荧光PCR仪）对荧光信号的实时检测，经过电脑分析以后，可以准确计算出目的基因的初始数量，实现定量检测。与传统PCR检测相比，荧光PCR检测技术不仅实现了PCR检测从定性到定量的飞跃，而且它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。因此，荧光PCR检测技术自二十世纪九十年
4、代中期出现以来，已成为最具代表性的PCR检测技术，为PCR检测技术临床应用打开了方便之门，现已得到广泛应用。,荧光PCR检测技术简介,短柄圆环探针荧光PCR原理,分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链，一般含有2535个核苷酸。在结构上，分子信标大体上可以分为三部分：（1）、环状区：一般由1530个核苷酸组成，可以与靶分子特异结合；（2）、茎干区：一般由58个碱基对组成，在分子信标与靶分子结合过程中可发生可逆性解离。（3）、荧光基团和淬灭基团：荧光基团一般连接在5端；淬灭基团一般连接在3端，常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团。根据Foerster理论，中心荧光能量
5、转移效率与两者距离的6次方成反比。所以只有荧光基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。,荧光标记,荧光发光是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态,而后产生发射光。常用的有绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白DsRed、CY3、CY5、FAM及其它荧光报告基团,探针荧光标记及,荧光基团：如红色荧光Cy3和绿色荧光Cy5标记探针淬灭基团常：用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）,影响分子信标的主要因素,分子信标中，荧光基团和淬灭基团之间的距离是影响分子信标的最主要因素。根据Foerster理论，荧光基团与淬灭基团之间的距离直接影响荧光的强度。另外，温度也是影响分子信标的一个
6、重要因素。在较低温度下，分子信标才可以保持发卡结构。在较高温度下，分子信标将无法保持其发卡结构，甚至使其伸展为随机线状，造成荧光基团和淬灭基团分离，从而发出荧光，出现假阳性结果。有文献表明，其熔链温度取决于茎干区的长度、G-C含量和缓冲液的离子强度,PCR反应特点,特异性强 灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。简便、快速PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加
7、好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。,实时荧光PCR结果判读,荧光PCR试剂盒检测结果,荧光域值（threshold）的设定,PCR反应管的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，即：threshold=10sd cycle6-15.荧光域值设定在PCR扩增的指数
8、期。,Ct值,在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念Ct值。C代表cycle，t代表threshold，Ct值的含义为每个反应管内荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，Ct值越小，起始拷贝数越多，反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，就可从标准曲线上算出该样品的起始拷贝数。,PCR诊断试剂生产管理要点,1、应具有阳性血清（或阳性质粒）处理、分装的隔离实验室2、PCR试剂的生产区与检定区应严格分开3、专用原材料 PCR引物的设计要合理、合适，
9、引物的合成要有固定的地方和设备，纯度能到达一定标准,荧光定量PCR试剂的质量检查操作程序,每次买来一批新试剂时，先观察外包装有无破损及有效期等，试剂运输过程中有无冷冻保存，如有异常，及时与厂家联系。内包装：试剂是否漏液，真空包装是否破损，试剂是否齐全以及是否有使用说明书等。试剂的灵敏度：取卫生部临检中心购买的已知拷贝数的血清1份，并稀释至10拷贝数，用新试剂检测，计算出灵敏度。试剂的重复性：取从卫生部临床检验中心购买的已知拷贝数的血清1份，用新试剂稀释平行检测10次，计算出SD，CV%。CV%应在30%。试剂的特异性：取临床标本10份（包括：低拷贝、高拷贝、阴性、高黄疸的标本各2份），用新试剂
10、检测，用于考察试剂的特异性。,荧光定量PCR室内质控程序,每天门诊抽取病人血标本时，须先仔细认真核对化验单和病人姓名是否符合。编完化验单号后，在对血标本进行编号时要仔细核对化验单的病人姓名与标本管上的姓名，不得有误。每次试验中，须同时测定1份阴性对照与一份质控品。首次制作质控图时（新批号开始时），采用“即刻法”质控方法，具体步骤如下：将连续的质控测定值从小到大排列，即X1，X2，XN计算均值(X)和标准差(S)按下述公式计算SI上限和SI下限SI上限=(X最大值-X均值)/2SI下限=(X均值-X最小值)/2,PCR定量为何要设内参照？,影响PCR定量的主要原因有1、反应效率的差异：可能为反应
11、体系和PCR扩增仪的工作状态所致。由于PCR产物增加按指数方式进行，所以扩增效率即使相差极小，也会极大改变产物的浓度。解决办法就是设内对照，使参照基因在同一反应管内进行PCR扩增，起到校正作用，这样，任何影响扩增效率的因素同样会影响两种模板。2、终产物浓度的影响：终产物浓度达到一定水平后，不会再保持指数式增长，而是进入平台期。解决办法：系列稀释待测模板，或在一定PCR反应周期后间隔测定PCR终产物的浓度。,PCR诊断试剂质量控制要点,1、酶活性测定2、引物序列的确定3、PCR加样区、扩增区、检测区应严格分开4、选择特异、敏感及简单快速的PCR产物检测方法,5、DNA聚合酶的活性及稳定性能达到一定的要求，并有固定的来源6、PCR产物检测方法要尽可能的可靠、快速方便7、PCR试剂盒的检定人员应进行专门的培训,PCR的假阴性和假阳性产生原因,假阴性：操作不当，试剂质量差（包括引物和探针设计不当）或过期、仪器设备不准确假阳性：几乎均由污染所致,
