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1、,siRNA和miRNA简介,20世纪50年代中期，人类发现生命的遗传物质是DNA双螺旋。这之后过了十多年，人们才发现了RNA，它们是联系DNA和蛋白质的“桥梁”，是细胞里的信使（信使RNA）、运输工具（转运RNA）和“车床”（核糖体RNA）上的关键零件，因此它们看起来好像一直在默默地干着一些替DNA跑腿的杂活。长久以来，生物学家们从来没有认为RNA会是生命中最重要的一份子。越来越多的证据清楚的表明，RNA在生命的进程中扮演的角色远比我们早前设想的更为重要。,前言,近些年来，人类发现了许多不同种类的RNA分子，其中最为重要的是小RNA分子的发现。有些小RNA分子 能直接调控某些基因的开关从而控
2、制细胞的生长发育并决定细胞分化的组织类型。在2002年度Science评选的10大科学成就中RNAi名列榜首。随着对小分子RNA研究的不断深入，研究人员开始认识到：小分子RNA的世界一点都不小。有人推测：小分子RNA可能代表一个新层次上的基因表达调控方式。,RNA的分类,细胞和和胞液 线粒体 功能,核蛋白体RNA rRNA mt rRNA 核蛋白体组成成分信使RNA mRNA mt mRNA 蛋白质合成模板转运RNA tRNA mt tRNA 转运氨基酸不均一核RNA hnRNA 成熟mRNA的前体小核RNA snRNA 参与hnRNA的剪接、转运小胞浆RNA scRNA/7SL-RNA 蛋白
3、质内质网定位合成的 信号识别体的组成成分,小RNA分子本身又包含了若干类RNA，根据小 RNA 的生成、结构和功能大约可分为以下几类：,小干扰RNA（small interfering RNA;siRNA）和微小RNA（microRNA；miRNA）是两种序列特异性地转录后基因表达的调节因子，是小RNA的最主要组成部分，它们的相关性密切，既具有相似性，又具有差异性。对小RNA的深入研究将使我们更深一步了解生命的奥秘。,概 念：RNA interference（RNAi）与靶基因序列同源的双链RNA所诱导一种序列特异性的转录后基因沉默现象。,RNAi 发现历程：1990年，曾有科学家给矮牵牛花插
4、入一种催生红色素的基因，希望能够让花朵更鲜艳。但意想不到的事发生了：矮牵牛花完全褪色，花瓣变成了白色！,?,1995年 康奈尔大学 Guo等在对线虫C.elegans的研究中，应用正义链RNA作为对照，研究par-1基因的表达，意外的发现，正义链RNA与反义链RNA同样能够抑制目的基因的表达。,1998年，Andrew Fire等首次将正义链反义链RNA混合注入线虫C.elegans中，观察到更强的基因表达抑制。首次提出了RNA interference的概念。,A control:not stainedB:wtC:wt+antisense RNAD:wt+ds RNA,Mex-3 mRNA
5、detection in embryos by in situ hybridization,RNAi机制,DicerRISC碱基互补酶解,short-interfering RNA,加工长链 dsRNA形成 21-23 nt 小片段,Dicer contains two RNAse III domains,siRNAs,long dsRNA,RISC:RNA-Induced Silencing Complex,Exonuclease,Homology search activity,Endonuclease,Helicase,5,3,形成RISC复合物，降解目的mRNA,RNAi 的生物学意义
6、：一种古老、保守而又极其重要的遗传学行为。生物体在长期的进化过程中对异常基因活动的监控和防御,有学者称之为“基因组水平的免疫系统”。一种抗病毒感染机制。,miRNA的研究起始于时序调控小RNA（stRNAs）。1993年，Lee等在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegan）中发现了第一个可时序调控胚胎后期发育的基因lin-4。2002年，Reinhart等又在线虫C.elegan中发现第二个异时性开关基因let-7。2001年10月science报道了三个实验室从线虫、果蝇和人体克隆的几十个类似C.elegan的lin-4的小RNA基因，称为microRNA。随后多个研究小组在
7、包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。对一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育进程，造血过程，器官形成，凋亡，细胞增殖，甚至是肿瘤发生。,What are microRNAs？（1）,miRNA是广泛存在于真核生物中的一组短小的、不编码蛋白质的RNA家族，它们是由19-25个核苷酸（nt）组成的单链RNA（3端可有12个碱基长度的变化）；miRNA的表达具有组织特异性和阶段特异性。即：在不同组织中表达有不同类型的miRNA,在生物发育的不同阶段里有不同的miRNA表达；编码miRNA 的基因可位于基因组的非编码区，以及编码
8、蛋白质基因的内含子、外显子和非翻译区。这些基因在基因组中成簇排列或分散排列。,What are microRNAs？（2）,miRNA具有高度保守性，即各种miRNA都能在其他种系中找到同源体；miRNA独有的特征：其5端第一个碱基对U有强烈的倾向性，而对G却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏U，一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C miRNA执行一定的生物学功能：对与其互补的mRNA表达水平具有调节作用；一些偏大的miRNA可能参与了基因组的重组装（27nt）；,miRNA的成熟,据体内外实验研究表明miRNA的生成至少需要两个步骤：1）由长的内源性转录本（pri-miRNA)生成
9、70nt左右的miRNA前体（pre-miRNA)，该过程发生在细胞核;2)将pre-miRNA加工为成熟miRNA，该过程发生在细胞质中。,Pre-miRNA,Pre-miRNA 是由内源性基因间区或内含子的DNA反向重复序列转录而来,它是一种长约70nt的非编码RNA,具有茎-环结构也即发夹状结构。Pre-miRNA在Dicer的作用下可被剪切成miRNAmiRNA 只是pre-miRNA 茎中的一个臂,miRNA与靶mRNA的作用模式：,1）二者不完全互补，即二者不完全配对结合时，主要影响翻译过程（阻遏翻译）而对mRNA的稳定性无任何影响。这种miRNA是目前发现最多的种类。如线虫的li
10、n-4。2）二者完全互补，即二者完全配对结合后，类似siRNA与靶mRNA的结合，特异性的切割mRNA。如miR39/miR171 当miRNAs 和编码蛋白质的mRNA 几乎完全配对时，miRNAs 诱导RNA介导（RNAi）的干扰途径。3）上述两种模式均具备。当其与靶mRNA完全互补配对时，直接靶向切割mRNA，而不完全互补配对时起调节基因翻译的作用。如let-7 果蝇/线虫。,miRNA的调控特点,交叉调节：动物miRNA与靶mRNA之间的不完全配对使得任何一个miRNA,都可能作用于不同的mRNA，一个mRNA也可能受到多个不同miRNA的调节。,自我调节：自我调节参与了miRNA 的
11、生物合成和功能。例如,参与,miRNA生物合成的一些酶也受到其产物miRNA的调节。Dcl1 mRNA编码一种植物Dicer蛋白参与miRNA的生成,同时它也是miR2162的靶分子。,可逆性调节：miRNA所致的翻译抑制在某些条件下是可逆的。当mRNA作,为miRNA抑制的靶分子后,mRNA 会被送至胞浆内的P 体(Pbodies)重新定位。,miRNA调节方式的优点,与蛋白水平的调节相比，更加节省能量,与转录水平调节相比，miRNA调节更迅速，而且是可逆的,内含子所编码的miRNA是一种对基因组资源的高效利用,microRNA基因组分布,60%独立表达 15%成簇表达,25%的miRNAs
12、位于内含子,植物与动物miRNA的区别,动物,植物,前体茎环结构,短，简单,长，复杂，折回长度变异明显,加工过程作用机制,先在细胞核，后在细胞质 仅在细胞核中大部分作为翻译阻遏子，大部分介导靶mRNAs小部分导致靶mRNAs降解 的降解,长度保守性,22-23nt高,21nt更高,经典理论：,2008 Nature,小结,miRNA的作用是多种多样的,它既可以通过关闭一些关键基因来改变细胞的命运，也可能与其靶基因产物相互作用形成调节环并与其他调节通路交织作用形成网络调控机制。,大多数miRNA并非独立作用,而是参与到复杂的基因调控网,络中。,据推测,人类三分之一的mRNA都被miRNA调控,随
13、着它们的,作用机理逐步明了,相信将会给人类带来更多的福音。,由于RNA 病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因,细胞中出现了dsRNA（注：病毒入侵，或者是自身合成RNA中出现错误，细胞内就会产生双链RNA，来阻止这些异常基因的表达）。Rde-1(RNAi缺陷基因-1)编码的蛋白质识别外源dsRNA，当dsRNA达到一定量的时候，Rde-1引导dsRNA与Rde-1编码的Dicer酶（Dicer是一种RNaseIII 活性核酸内切酶）结合，形成酶-dsRNA复合体。,在Dicer酶的作用下，这些双链RNA被加工成20-25nt的siRNA，而后这些siRNA被组装进入一种RNA诱
14、导的沉默复合体（RNA-inducedsilencing complex，RISC，由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶mRNA进行识别和切割）。最后，这些siRNA与靶mRNA分子互补配对，并引导RISC剪切、降解RNA分子。因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调控机制。,小干扰RNA（small interfering RNA;siRNA）和微小RNA的异同点,miRNA与siRNA的作用机制：,miRNA与siRNA的区别：,miRNA 产生：细胞内RNA的固有组 分之一（正常）来源：内源转
15、录本直接来源：发夹状pre-miRNA 结构：单链互补性：不完全互补，存在 错配现象对靶RNA特异性：相对较低，一个 突变不影响miRNA的 的效应途径：miRNA途径对RNA的影响：在RNA代谢的 各个 层面进行调控功能：调节内源基因的表达 在蛋白质合成水平发挥作用，与mRNA的稳定性无关,siRNA RNAi的活性形式，病毒感染和人工插入dsRNA之后诱导而产生（异常）转基因或病毒（外源）长dsRNA 双链，3端有2个非配对碱基，通常为UU 完全互补 较高，一个突变即引起RNAi 沉默效应的改变 RNAi途径 降解靶mRNA 抑制转座子活性和病毒感染 在转录后水平发挥作用，影 响mRNA的
16、稳定性,miRNA与siRNA的联系,miRNA与siRNA的区别,miRNA不爽地说，“因为siRNA先被人注意到，所以它在我之前成名。”接着，miRNA意兴昂然地讲起了它的身世“话说在“广袤”的细胞质中游荡着一个名叫Dicer的浪子。与此同时，在细胞的腹地细胞核中，一个身形颀长的RNA降生了即pri-miRNA。Dicer在细胞质中遇到了一个双链的RNA并被她所吸引，于是尾随她并最终在她身上咬了一口，结果siRNA降生了。Dicer又继续游荡，这时他看到了一个非常漂亮的发夹状的RNA（她其实就是在细胞核中降生的那条RNA的化身pre-miRNA），于是非常仰慕并最终历经艰辛将她咬了一口。这
17、样我就“哇”的一声来到了这个世界上”miRNA说。“我和siRNA有许多共同点，但我们的差别也很多，所以可别把我们混在一起哦，”它补充说。,在RNA干涉中，小RNA（siRNAs 或 miRNAs）被用来调控基因表达。它们作为特征因子，将 RISC复合物引导向互补的mRNA目标。RISC的一个主要成分是Argonaute（Ago）家族的一种蛋白。现在，独立进行研究工作的两个小组发现了一类新的小RNApiRNA，它们与Argonaute家族的一个分支、即Piwi类蛋白发生相互作用。Piwi蛋白代表着Ago蛋白家族中的一个分支(subclade)，首次在果蝇(Drosophila)中发现，起着调节
18、生殖干细胞维持的作用。随后也发现哺乳动物的Piwi蛋白成员调节着生殖细胞的成熟。这类小RNA可以抑制遗传“入侵者”转位（座）因子，保护基因组不受破坏，也可改变基因活性。比以前所描述的小RNA稍长一些，长度通常在29-30nt。,piRNA,2005年Cell：美国怀特黑德生物医学研究所和马萨诸塞理工学院的科学家借助一个计算模型来确定小和对应的基因，发现了小控制很大一部分生命功能的证据。研究人员比较了人类和狗、鸡、鼠的基因组，对这几个物种共有的蛋白质合成基因与小寻求对应关系。结果发现，尽管这几个物种在.亿年前就开始“分家”各自进化，但它们基因组中受小调控的基因都占三分之一左右，而且这些基因在进化
19、过程中都得以保存而未发生变化。,研究进展,最近几年来，已有文献报道microRNA的异常表达与特定的肿瘤具有相关性。俄亥俄州立大学癌症中心的研究人员对比人类胰腺癌组织、癌组织附近的正常组织，以及对照组中的microRNA（miRNA）的表达水平，发现大约有100种 miRNA在癌组织中超正常水平表达。研究结果刊登于2006年12月5日网络版InternationalJournalofCancer。提示这些miRNA也许能成为检测胰腺癌的信号或者治疗靶标。,美国科学家的一项研究表明，一种微小的RNA分子（即microRNA）能够促使乳腺癌细胞肆虐和扩散，相关论文2007年9月26日发表于自然杂志
20、。从之前29种与乳腺癌相关的microRNA中，研究人员确定出一种名为miR-10b的“凶犯”，它不仅在非转移癌细胞中起作用，在一种极富侵略性的人类乳腺癌细胞系中也十分流行。当研究人员将miR-10b灭活后，这些细胞的侵略性减少了十分之一。而当科学家将miR-10b导入非转移乳腺癌细胞培养基后，这些癌细胞变得极富侵略性，转移能力很强。研究人员最终确定了影响miR-10b活性的遗传路径。他们发现，该microRNA的制造要受到一种名为Twist的基因的控制，该基因此前被认为是胚胎发育的“主要调控因子”。反过来，miR-10b也会影响另外两种与细胞迁移和癌症形成相关基因的表达。,在最新一期（200
21、9年）基因和发育杂志网络版上，美国怀特海德研究所和新加坡国立大学的研究人员发表报告称，他们发现了可破坏肿瘤抑制基因p53活性的一小段RNA(即小RNA)。尽管研究人员之前就曾发现其他基因和小RNA也能调控p53基因的活性，不过这种调控是间接的，而此次研究人员首次证明了小RNA可直接影响p53基因。,Science2007.1 microRNA就像是“分子变阻器，精调着每个基因的蛋白合成。”这就解释了为什么microRNA总是出现在合成蛋白的分子机器周围。已知的人类microRNA总共有500多个，研究者从中挑选了200多个仔细加以研究，有一个microRNA分子径直进入核内。对于这个“任性”的
22、microRNA分子，研究者们给了它一个特别的名字miR-29b。与其他的microRNA分子一样，miR-29b也基本由20-25个核苷酸组成；但它也有别出心裁的地方，末端的6个核苷酸与其他的microRNA分子截然不同。研究者将这六核苷酸切下并粘合在其他的microRNA分子上，研究者们发现新组装的microRNA的行踪与miR-29b一样诡异，不“理睬”细胞中蛋白合成的分子机器，径直进入细胞核。接着，研究者将同样的六核苷酸接合到小干涉RNA或称siRNA，同样的现象再次出现：六核苷酸序列将siRNA分子“领”入核中。对于这些实验结果，Mendell的解释是microRNA分子虽然短小，但
23、是它们依然包含着一些重要元件由简单的几个核苷酸组成即可。这些元件可以调控microRNA在细胞中的一举一动。可以想象本实验中，miR-29b的六核苷酸序列就像是邮政编码，指导着miR-29b在细胞中的定位。,在公布在细胞杂志上的研究中，洛克菲洛大学的Gaul和同事通过封闭在果蝇早期发育中起作用的46个miRNA，从而证明这些miRNA的大多数与发育息息相关。佛罗里达大学的研究人员发现当miRNA不能关闭特定基因时，小鼠就会长成畸形。刊登在自然杂志上的一项研究表明miRNA在心脏细胞的生长和分化过程中扮演极其重要的平衡角色。,2008 PNAS 武汉同济医院泌尿外科医师、现任美国加州大学旧金山分
24、校助理研究员李龙承博士经过将近三年的研究，发现小分子在人细胞中具有基因激活功能，能命令细胞在短时间内大量生产某个“有利”基因，比如在癌细胞中的抑瘤基因，从而达到治疗疾病的目的。他将该发现命名为“激活”。用“RNA干扰”治疗某一肿瘤时需要有明确的致癌基因作为攻击目标，但不是所有的肿瘤能找到致癌基因；而“RNA激活”则可以通过选择性的激活或增强某个抑瘤基因的表达，来遏制肿瘤生长，不需要明确找到肿瘤特定的致癌基因，这样将大大提高肿瘤的治疗效果。,对microRNA的调控研究发现，microRNA（miRNA）对哺乳动物免疫系统具有重要的调控意义。研究者发现用遗传技术敲除某一miRNA或是消减某一mi
25、RNA基因的功能（与免疫功能相关的miRNA），对免疫系统的发育会造成重大的破坏作用，导致机体发生疾病，比如说，可能引发自体免疫疾病甚至是癌症。尽管，单个的miRNA就能调节上百个靶位基因影响蛋白表达，一旦影响蛋白的表达就会对生物体的正常生理功能造成影响，也许某些关键蛋白表达量的降低会招来恶果，导致细胞功能异常，甚至产生疾病。可以肯定，miRNA并非身体中的“超高级智能”分子，它虽然主要是作为调节性因子而存在，但它也必然是受到其他“暗物质”的调节。已经有研究发现一种叫做c-Myc的转录因子能调节miRNA。,小RNA（miRNAs）已知能够在转录水平上控制基因的表达水平，但是它对蛋白质组会产生
26、怎样的影响呢？两项发表在自然杂志上的最新研究表明，单个miRNA能够影响数百种蛋白质的表达。这两篇论文都表明，单个miRNA能够对全部的蛋白质表达产生影响，而蛋白质抑制可能被相应mRNA中的一个种子互补区域所调整。由此形成的图画是miRNA并不仅仅含有小数量的mRNA靶点它们的功能在于巧妙调节蛋白质组的转录和转化水平。,Nature 2008Kawamura等人识别出另一类小RNA，即内生短干涉RNA（endo-siRNAs），其中很多都是从反转录转座子中表达并抑制后者的，但却是在体细胞中。有趣的是，endo siRNAs 和piRNAs与在RNA抑制中所涉及的不同亚族的Argonaute蛋白
27、发生相互作用。在这项研究工作中，Czech等人识别出果蝇的新一类小RNA：内生短干涉RNA（endo-siRNAs）。这些 RNAs既存在于体细胞中，又存在于生殖细胞中。它们的处理不同于miRNAs 或 piRNAs 的处理；它需要的是Dcr2以及 Loqs（Dcr1伙伴）而不是Dcr2通常的伙伴 R2D2，这一点是不同寻常的。所处理的endo-siRNAs是被发现优先与Argonaute蛋白AGO2相结合的第一类小 RNAs，这种复合物以编码蛋白以及移动元素的基因为目标。,2011年9月，cell research,过去，生物科学界认为，微小RNA仅能供生物体本身使用，而且人体的血清中含有许
28、多RNA降解酶，动物和植物中的RNA不可能在人体内完整地存在。2011年9月，cell research杂志刊登了南京大学张辰宇团队的研究结果：植物中的一些微小RNA会通过进食方式进入人体，并控制人体的基因活性。这项研究发现，植物所含有的微小RNA能够通过消化道进入人体血液和器官组织，然后通过调控人体内靶基因表达的方式，影响人的生理功能。他们已经发现了至少一种情况，微小RNA能够通过这种方式影响人体健康：进食过多的大米会增加患代谢紊乱综合征的可能。,他们还发现，中药在经过煎煮之后，药汤里的微小RNA的浓度很高。给小鼠喂药之后24小时，就发现小鼠肺部相应的微小RNA浓度增高。他们认为，这些发现为
29、在传统的中草药中发现一类全新的活性分子提供了依据。,该发现显然发人深省：比如，它表明除了吃“食物”（以碳水化合物及蛋白质等的方式）以外，您还在摄入“信息”（此信息即是微小核糖核酸的序列特征，因为来源于不同食物的多种多样的微小核糖核酸一旦被人体吸收，将导致潜在的不同类型的靶基因的调控以及对人体的生理状况产生不同的影响结果）。该发现从一种新的维度对于中国的古语“吃什么补什么”进行了科学解释。,该发现的潜在意义还在于：一，该研究显著地扩展了微小核糖核酸的功能；二，该研究提出了一个极其奇妙并且创新的观念，该观念对于人类健康和代谢产生了深远的影响；三，该研究为我们理解跨“界”（比如动植物间）的相互作用甚
30、至是共进化（co-evolution）提供了新的线索，也为我们思考微小核糖核酸的调控作用以及思考来源于食物、植物以及昆虫的外源性微小核糖核酸在猎物和捕食者间的相互影响中的潜在作用开辟了新的道路；“动物、植物之间如何的借着微小RNA互相调控的？大家说不定共进化了。”张辰宇说。,四、该研究证明植物微小核糖核酸可能是食物中的“第七种营养成分”（其他六种分别是水、蛋白质、脂肪酸、碳水化合物、维生素和矿物质）；五、该研究为代谢紊乱症的发生发展提供了一种新的分子机制；六、对于中国人来说，还为在传统的中草药中发现一类全新的活性分子提供了依据。,所有的细胞，首先能够选择性地把特定的微小RNA包裹到微小囊泡中去
31、，当细胞受到刺激的时候，细胞就会把这些包含微小RNA的微小囊泡分泌到循环系统中，或者是细胞外。然后，这些微小囊泡能够把微小RNA再运送到靶细胞内，释放出微小RNA，作用于靶细胞内的微小RNA的靶基因，从而调控靶细胞的生理学或生物学功能及状态。“我们发现了细胞能够分泌微小RNA，把已知的细胞间的信号传导机制从固定电话变成了手机。”张辰宇形容说，“原来是特定的细胞能够分泌一些激素或者细胞因子，特定细胞有受体再接受，现在变成是所有的细胞都有这个能力分泌，只要受到刺激。”,展望,如果miRNA基因正如所发现的miRNA一样多，那么它很可能在生命活动中具有十分广泛的调节功能，对基因表达、生长发育和行为等
32、都具有十分深远和复杂的效应。当前我们所面临的挑战是：这些miRNA到底具有何种功能？它们是如何识别潜在的靶mRNA的？这些miRNA间相互调节作用的结果是什么？,寻找miRNA的方法：,A 分子生物学的方法 B 分子信息学的方法：应用计算机的方法如MirScan来寻找miRNA分子已经在线虫及脊椎动物体内取得了巨大的成功。2004年6月，吳政道在前述的计算机方法的基础上提出一种可以进行高通量筛选miRNA靶位点的方法,小结,从前述的诸多信息，我们可以得出一个结论，那就是RNA不再只是作为DNA与蛋白质之间的中介发挥作用，而是参与到了基因的表达调控、RNA的定点修饰，以及染色体的结构组织等各个方面。短短几年内miRNA研究的迅速突破，不只是RNA研究的一个新突破，更是为人们提供了一种全新的认识基因和基因表达调节本质的角度，同时也使人们开始注意miRNA在疾病发生过程中所扮演角色。,
