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1、荧光定量PCR技术在临床检测中的应用,黄少军 市中心医院,PCR与基因诊断技术,基因诊断即通过核酸的分子生物学检测直接检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热酶的作用，可在3个小时内把特定的DNA片段扩增1000万倍。九十年代中期PCR临床应用在国内全面开展，1998年，荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测。,4 基因诊断,3 免疫学诊断,临床诊断,细胞膜,细胞核,DNA,转录,mRNA,翻译,蛋白质,1 形态学诊断,2 生
2、化诊断,概念,基本原理,以DNA为例（1）DNA变性：（2）降温退火：（3）引物延伸：,原理 第一步 加热变性,预处理,第二步 引物与靶序列退火,第三步-引物延伸,第1个 PCR 循环完成后 得到两个拷贝的靶序列,PCRPCR.exe动画,30次循环后靶序列扩增的数量,No.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,824,荧光PCR的原理,PCR技术的特点,灵敏度高 特异性强 快速简便 应用范围广,Ct值的意义,Ct值与重复性同一样本在相同条件下同时进行96次扩增,FQ-PCR,Ct值与
3、浓度不同的模板达到荧光域值时的Ct值不同,感染性疾病的诊断 母婴传播的控制与观察 遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断 法医学鉴定,荧光定量PCR的临床应用,早期诊断 病情评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察、指导 新药验证,一 感染性疾病 1.病原体含量与病情之间的关系 2.病原体含量与用药之间的关系 3.药物及疗法的研究与开发 4.新的病原体分子诊断标准 5.新的愈后指标 6.传染病发病的监控、预测与预防,临床应用,临床应用,二 肿瘤1.肿瘤标志物：癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、细胞因子、受体等2.肿瘤相关基因表达的检测：包括癌基因抗癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因,三 遗传病1.等位基因检测2.
4、多基因遗传病的突变检测3.基因表达异常所致遗传病检测,1.亲子鉴定 2.法医物证 3.PCR-RFLP技术的法医学应用 4.罪犯鉴定,法医鉴定,免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的“窗口期”，不利于对疾病的早期诊断；PCR方法直接检测病原体的DNA/RNA，能大大缩短“窗口期”，其高灵敏度的检测显然也有利于疾病的早期诊断。,疾病的早期诊断,荧光定量PCR在病原体检测中的应用,一 肝炎病毒定量检测二 性病病原体检测三 结核杆菌及呼吸道病原体检测四 优生优育(TORCH)相关项目检测,临床应用,肝炎病毒定量检测HBVHCV,临床应用,（
5、一）乙型肝炎病毒结构及特点,HBsAg：是HBV感染的主要标志HBsAb：保护性抗体HBcAg：仅存于感染的肝细胞核内，一般不存在于血循环中HBcAb:非保护性抗体，HBcAb-IgM提示HBV处于复制状态HBeAg：HBV复制及强感染性的指标HBeAb：有一定的保护作用，预后良好,HBV,HBV,（二）HBV-DNA与“两对半”,1.“两对半”：机体的免疫反应状态；,2.“携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能 反应体内病毒复制水平与感染程度。,FQ-PCR：检测的是HBV本身的遗传物质DNA，是 病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。,3.血清学指标()不能排除HBV感染。,HB
6、V,（二）HBV-DNA与“两对半”,4.也可能出现HBsAg()，HBV-DNA()。,5.HBsAb()、HBcAb()、HBeAb()三抗体阳性 与HBV DNA 2.5 103 copy/ml 结果解释。,HBV,(三)HBV-DNA定量检测的临床意义,3.HBV-DNA定量与预后 a.含量高者急性肝炎患者易慢性化 b.癌变的几率明显高于含量低者,1.HBV-DNA定量与HBV复制水平及传染性,2.HBV-DNA定量与乙肝药物疗效 a.专家提出103 copy/ml做为阴性或临床治愈标准 b.HBV-DNA定量分析与干扰素治疗(前、中、后)c.拉咪呋啶,HBV,(三)HBV-DNA定量
7、检测的临床意义,4.HBV-DNA定量有助于指导怀孕与孕期，哺乳期检查,6.血液制品和献血员的筛选,HBV DNA检测的临床意义,HBV DNA是HBV存在最直接的依据HBV DNA是HBV复制的标志HBV DNA是患者具有传染性的标志HBV DNA对乙肝两对半起补充作用HBV DNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标HBV DNA可检测出隐匿性慢性乙型肝炎,病毒特点：1.单正链RNA病毒 2.E1和E2区基因高度变异性,（一）丙型肝炎病毒特点,HCV,感染特点：HCV在血中含量极微 输血后肝炎主要致病因子免疫学标志仅有抗-HCV，非中和抗体，产生时间不一有一部分人感染HCV后，不产生抗
8、-HCV 感染易于慢性化(50-85%)疫苗研制尚不成功,单链RNA,(二)HCV-RNA定量检测的临床意义,1.早期诊断 a.临床以 80 copy/ml做为无感染或治愈标准。b.HCV感染1-3W，即可检出HCV-RNA的存在。c.严格筛选献血员,提高对窗口期感染者的检出率。,HCV,HCV,(二)HCV-RNA定量检测的临床意义,2.HCV-RNA载量与抗-HCV滴度、ALT水平之间的相关性。抗-HCV滴度和ALT异常率随着HCV-RNA载量升高而增加。,3.HCV-RNA是评价抗病毒治疗效果的重要指标。,4.慢性丙型肝炎长期抗-HCV阳性，这时如果进行HCV-RNA 定量检测可以鉴别活
9、动性、复制程度。,二常见性传播疾病病原体,一淋球菌（NGH）二沙眼衣原体（CT）三解脲脲原体（UU）四梅毒螺旋体（TP）五单纯庖疹病毒（HSV）六乳头瘤病毒（HPV）七人类免疫缺陷病毒（HIV）,STD,NGH,淋球菌感染与致病,1.人是淋球菌的惟一宿主。,2.发病率最高，在所STD疾病中，高达60%左右。,3.发病趋势：a.男性多于女性。b.城市走向农村，c.高收入阶层向低收入阶层扩展,4.人对淋球菌感染无天然抵抗力，免疫不持 久，再感染和慢性患者普遍存在。,5.如母亲为淋病患者，婴儿出生时易患上淋球菌性结膜炎,CT,沙眼衣原体感染与致病,1.严格的细胞内寄生。,2.不仅可致眼部感染、肺部感
10、染、也是STD的主要 病原体。,3.近年来在欧美等国，沙眼衣原体的感染率和危害 性已超过淋球菌而居STD之首。,4.在我国，在非淋球菌性尿道炎中，居首位。,5.泌尿生殖道感染，妨碍妊娠。,6.盆腔感染，可致生殖能力损害。,UU,解脲脲原体感染与致病,合成尿素酶，分解尿素,2.在非淋球菌性尿道炎其感染率仅次于衣原 体感染，居第二位。,3.流产超过4次以上者，检出率高达80%。,4.有30-40%男性尿道炎是由感染UU所致。,5.与男性不育相关。男性不育患者精液中，脲原体检出率高达66.6。检出率随精子数减少和精子活动力下降而升高。,1.非培养或形态学检查的诊断技术，快速、特异、敏感。2.对无症状
11、或症状轻者，可以早期确诊。3.对NGH、CT、UU 等混合感染者，诊断和鉴别诊断。4.指导用药、考核疗效。,荧光定量PCR诊断NGH/CT/UU的意义,NGH/CT/UU,NGH/CT/UU,荧光定量PCR诊断NGH/CT/UU的意义,5.不孕不育、优生优育。6.流行病学调查，为性传播疾病的监控提供依据。,CT、UU、NGH、HPV、TP除NGH可培养外，其余难培养或者不能培养。即使能培养，所需时间长48小时。,人乳头瘤病毒感染与致病,1.HPV具有宿主和组织特异性，只能感染人的皮肤和黏膜上皮细胞，人是HPV的惟一宿主。2.有100多个型。3.低危型：HPV 6、11引起良性病变(尖锐湿疣、喉
12、乳头瘤等),HPV,人乳头瘤病毒感染与致病,HPV,4.高危型：HPV 16、18引起恶性肿瘤(宫颈癌、肛门癌、口腔癌等)5.免疫原性低，易形成持续性感染。6.新生儿产道感染。,看看这些英年早逝的艺人，她们死于宫颈癌宫颈癌的知晓率在不断提高。,梅艳芳(40岁),国家一级演员李媛媛(41岁),HPV,1.对典型病例可以明确诊断。2.对临床表现和组织病理改变都不典型的病例同样可以做出诊断。3.对亚临床和隐性HPV感染做出诊断。4.基因分型。5.考核疗效与预后。6.病毒载量与患癌症风险。,HPV,荧光定量PCR检测HPV的意义,HPV,三结核杆菌与呼吸道病原体检测,TB：Tubercle bacil
13、liCP：Chlamydia pneumoniaMP：Mycoplasmal pneumoniaSARS：severe acute respiratory syndrome,结核杆菌流行现状（1）,罗伯特科赫（），德国细菌学家，结核杆菌发现者 结核病是一个全球性的问题，近年来在世界范围内出现流行，且呈增长的趋势,TB,结核杆菌流行现状（2）,我国结核病的疫情仅次于印度而居世界第二位 2000年，全国人口结核感染率为44.5%，其中1544岁人群占了53，每年约有25万人死于结核病,结核杆菌引起的感染,肺部感染：原发性肺结核，开放性肺结核。肺外感染：脑、肾、骨、关节、生殖结核、肠结核、结核性腹膜
14、炎、全身性结核。,常规结核病实验室诊断方法及不足,1.痰涂片作抗酸染色：阳性率低、费时2.细胞培养“金标准”：周期太长(3-4W)3.血清学诊断：a.接种BCG可出现阳性 b.不能区分活动性结核病和治愈后留下损伤灶的病人 c.交叉反应，假阳性不能早期诊断！容易漏诊、误诊！,TB,荧光定量PCR检测TB-DNA的意义,1.能稳定检测10copy的TB-DNA，灵敏度高，特异性强2.早期、快速、准确地诊断结核病。痰液、肺及支气管灌洗液肺结核 血液播散性结核和各脏器的结核病 脑脊液中枢神经系统结核病 宫颈拭子、尿道拭子泌尿生殖道结核病,TB,3.荧光定量PCR检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色
15、和改良罗氏培养法。4.TB-DNA浓度可用于判断疗效：痰标本中结核杆菌的数量呈逐渐下降趋势，TB-DNA拷贝数下降。根据病原体DNA浓度，对药物治疗及疗效观察提供参考依据,TB,荧光定量PCR检测TB-DNA的意义,四TORCH感染特点与检测,TOX:Toxoplasma gondiiRV:Rubella virus CMV:Human cytomegalovirusHSV:Herpes simplex virus,TORCH,TORCH感染特点,1.母-胎传播的主要病原体 2.引起胎儿畸形新生儿缺陷的重要原因3.自然状态下呈隐性感染4.怀孕、多次输血、AIDS等易发生显性感染 5.可致多发性
16、、全身性感染6.只有风疹可获得长久的免疫力，可用疫苗预防,TORCH,(一)弓形虫感染与致病,滋养体如弓形，广泛分布，人兽共患。寄生在有核细胞中，猫和猫科动物是终宿主易感者多，免疫者少 我国智力低下儿的弓形虫感染率28 畸形儿的弓形虫抗体IgM阳性率12.25 艾滋病患者约有2080合并弓形虫感染，造成艾滋病死亡的一个重要并发病,TORCH TOX,人群自然感染率达到60-90%，多为隐性感染免疫功能低下(怀孕、多次输血、器官移植、AIDS)发生显性感染可发生垂直传播，是宫内感染和胎儿畸形的主要病毒之一围生期感染血、尿、乳汁、精液、分泌物中都可检出病毒,(二)人巨细胞病毒感染与致病,TORCH
17、-CMV,风疹是一种世界性的病毒传染病，是造成畸胎及先天性疾病的病毒之一 出疹前1周至出疹后5天均有传染性人是风疹病毒的唯一宿主 风疹感染后可获得持久的免疫力，临床显性再感染并不多见。,(三)人风疹病毒感染与致病,TORCH-RV,先天性风疹感染往往发生在母体初次感染之时，可致先天性风疹综合症(CRS)三联症：白内障、耳聋、心脏病。妊娠时体内皮质类固醇激素的增加以及细胞免疫功能的减弱，这种对正常人无害的再感染有可能造成病毒蔓延以至影响胎儿。,TORCH-RV,(三)人风疹病毒感染与致病,HSV原发感染多为隐性，大多无临床症状或呈亚临床表现 HSV-1主要引起口唇疱疹，疱疹性结膜炎、脑炎，皮肤性
18、疱疹HSV-2主要引起原发性生殖器疱疹(80%)。HSV感染后大多数个体不能彻底消灭病毒，也不能阻止复发，病毒以潜伏状态长期存在宿主体内。,TORCH-HSV,(四)人单纯疱疹病毒感染与致病,妊娠期妇女因HSV-1被激活，可通过胎盘感染胎儿，引起胎儿畸形、智力低下、流产等。围产期感染可引发新生儿疱疹，死亡率高达50%以上。HSV常与HIV-1同时感染，并能促进病情发展，引起严重的局部和播散性感染。目前认为HSV是一种调节因素，能激活HIV复制 与宫颈癌关系密切。,TORCH-HSV,(四)人单纯疱疹病毒感染与致病,常规TORCH检测方法与不足,组织培养或病原体分离：慢，费力，阳性率低。血清学诊
19、断：IgG：人群自然感染率高达60-90%。IgG()不能区别既住感染与现症感染；新生儿IgG()不能说明有感染。IgM：IgM()可能是原发性感染；IgM()不能排除感染。,TORCH,局限性：1.不能定量分析 2.抗体的产生受多种因素的影响 3.交叉反应，假阳性,荧光探针检测TORCH的优势,原理：直接检测TORCH病原体的核酸优点：灵敏、快速，特异 意义：早期诊断，妇幼保健、优生优育1.筛选TORCH患者，提高出生人口素质。2.有利于预测胎儿宫内感染状况及妊娠结局。3.TORCH感染孕妇的治疗效果观察。4.器官移植、免疫系统疾病等病人监控。5.建立TORCH的分子诊断标准,TORCH,T
20、ORCH,TORCH检测核酸与检测标本的比较,检验结果解析,HBV-DNA定量结果定量测定，测定的是病毒量的“多”或“少”；结果报告方式：多少？，多少？具体值？,举例,例如：试剂盒检测范围是103108IU/ml,我们测定的阴性结果应报告 103 IU/ml；（无、含量低）。中间值报告具体数据；当含量高于最高检测限时，报告108 IU/ml。（108 IU/ml；109 IU/ml.）参考范围?,IU/ml与COP/mlD的换算-咨询厂家 3.5E+05 IU/ml-表示一毫升血清中有350，000个HBV病毒微粒。,HBVDNA的变化,在患者治疗过程中检测HBVDNA定量，一般认为：其结果相
21、差5倍属正常波动，结果相差降低10倍以上才算治疗有效。,例如1,有一患者治疗前检测HBV-DNA定量为8.8E+06 IU/ml，治疗一月后复查为2.3E+07 IU/ml，两结果相差2.6倍。（不一定是高了？）如何向病人解释：属正常波动或者检测误差（允许误差）,例如2,一患者治疗前检测HBV-DNA定量为9.2E+06 IU/ml；治疗一月后复查为2.8E+06 IU/ml，两结果相差3.3倍，不能说明治疗有效，需要继续观察。要有明显的下降趋势。,检验报告单结果读取,3.637E+06 检测下限:1000拷贝/毫升3.637106 1.000E+03 copy/ml,如果是标本量是可以定量的，如血液、脑脊液等，则检测结果报告为：copy/ml如果是标本量不能定量，如分泌物等，则结果只能报告为：copy,Thank You!,
