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1、色 谱 分 析,主讲：付大友,（Chromatography Analysis）,内容,1 绪 论 2 色谱理论基础 3 色谱定性定量方法4 气相色谱分析 5 高效液相色谱分析6 超临界流体色谱和毛细管电泳 7 色谱联用简介8 计算机技术在色谱分析中的应用,6超临界流体色谱和毛细管电泳,超临界流体色谱毛细管电泳,6-1 超临界流体色谱,超临界流体色谱的特点、性质与原理超临界流体色谱仪的结构流程超临界流体色谱流动相超临界流体色谱的应用超临界流体色谱法与其他色谱法比较,超临界流体色谱的特点,超临界流体：在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于液体和气体之间。超临界流体色谱(SFC)，8
2、0年代快速发展，具有液相、气相色谱不具有的优点:（1）可处理高沸点、不 挥发试样；（2）比LC有更高的柱效 和分离效率。,超临界流体性质,（1）性质介于液体和气体之间;具有气体的低黏度、液体的高密度，扩散系数位于两者之间。（2）可通过改变超临界流体的密度（程序改变）调节组分分离（类似于气相色谱的程序升温，液相色谱中的梯度淋洗）。超临界流体的密度与压力有关。,原理,SFC的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3 SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱SFC和毛细管柱SFC；分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离
3、；通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分保留值；,压力效应,SFC的柱压降大（比毛细管色谱大30倍），对分离有影响（柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）；超临界流体的密度受压力在临界压力处最大，超过该点，影响小，超过临界压力20%，柱压降对分离的影响小；压力效应：在SFC中，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。CO2流动相，当压力改变：7.09.0106 Pa，则：C16H34的保留时间 25min 5min。,程序升压,超临界流体色谱的结构与流程,主要由高压泵、进样器、色谱柱、检测器、记录装置和温度控制装置组
4、成。,其中高压泵、进样器、检测器记录和温度控制装置与气相色谱或高效液相色谱类似，可采用气相色谱或高效液相色谱的部件，常用的检测器为氢火焰离子化检测器，其次是紫外-可见、荧光检测器。填充柱的超临界流体色谱柱可采用液相色谱柱，毛细管超临界流体色谱可采用气相色谱的交联毛细管柱，也可购买厂家专门制备的超临界流体色谱柱。,超临界流体色谱流动相,SFC的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3 CO2应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；加少量甲醇等改性；CO2的超临界温度31.3，超临界压力为7.4MPa,超临界流体色谱的应用,1.聚苯醚低聚物的分
5、析色谱柱：10m 63m i.d.毛细管柱，固定相：键合二甲基聚硅氧烷；流动相：CO2；柱温：120 C；程序升压；,2.甘油三酸酯的分析四种组分仅双键数目和位置不同，难分离；色谱柱：DB-225 SFC毛细管柱；流动相：CO2；从15MPa程序升压到27MPa；2.5hr完全分离,超临界流体色谱法与其他色谱法比较,（l）与高效液相色谱法比较 实验证明SFC法的柱效一般比HPLC法要高：当平均线速度为0.6cmS-1时，SFC法的柱效可为HPLC法的3倍左右，在最小板高下载气线速度是4倍左右；因此SFC法的分离时间也比HPLC法短。这是由于流体的低粘度使其流动速度比HPLC法快，有利于缩短分离
6、时间。,（2）与气相色谱法比较 出于流体的扩散系数与粘度介于气体和液体之间，因此SFC的谱带展宽比GC要小；另外，SFC中流动相的作用类似LC中流动相，流体作流动相不仅载带溶质移动，而且与溶质会产生相互作用力，参与选择竞争。还有，如果我们把溶质分子溶解在超临界流体看作类似于挥发，这样，大分子物质的分压很大，因此可应用比GC低得多的温度，实现对大分子物质、热不稳定性化合物、高聚物等的有效分离。,（3）应用范围的比较 下图描绘了SFC与其他色谱方法测定相对分子质量范围的比较。由下图看出SFC比起GC法测定相对分子质量的范围要大出好几个数量级，基本与LC法相当。当然，尺寸排阻色谱法（SEC）所测分子
7、质量范围是所有色谱法中最大的。超临界流体色谱法被广泛应用于天然物、药物、表面活性剂、高聚物、多聚物、农药、炸药和火箭推进剂等物质的分离和分析。,6-2毛细管电泳,毛细管电泳分析概述毛细管电泳理论基础毛细管电泳仪毛细管电泳分离模式毛细管电泳应用与进展,毛细管电泳分析概述,电泳定义经典电泳高效毛细管电泳电渗现象与电渗流毛细管电泳分离过程毛细管电泳特点,电泳定义,在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶
8、液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和、球蛋白。由此发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定，第一次的自由溶液电泳，并制成了第一台电泳仪，于1948年获诺贝尔化学奖；,经典电泳,利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳；按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳；传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅
9、速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术高效毛细管电泳。,高效毛细管电泳,高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：一是采用了0.05mm内径的毛细管；二是采用了高达数千伏的电压。毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。,电渗现象与电渗流,当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。当液体两端施加电压时，就会
10、发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmotic flow，简称EOF）。,高效毛细管电泳分离过程,电场作用下，毛细管柱中出现电泳现象，形成电渗流。,带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反。电渗流 电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。,高效毛细管电泳特点,1.仪器简单、易
11、自动化 电源、毛细管、检测器、溶液瓶2.分析速度快、分离效率高 在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内 分离了24种阳离子；分离柱效：105107/m理论塔 板数；3.操作方便、消耗少 进样量极少，水介质中进行；4.应用范围极广 有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；,高效毛细管电泳理论基础,毛细管电泳(CE)基本原理CE中的电渗现象与电渗流影响电渗流的因素淌度CE中的参数与关系式影响分离效率的因素,毛细管电泳(CE)基本原理,电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度。当带电离子以速度 在电场中移
12、动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。电场力：FE=qE 阻 力：F=f故：qE=fq离子所带的有效电荷；E 电场强度；离子在电场中的迁移速度；f 平动摩擦系数(对于球形离子：f=6；离子的表观液态动力学半径；介质的粘度；),所以，迁移速度：,物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。淌度：单位电场强度下的平均电泳速度。,CE中的电渗现象与电渗流,石英毛细管柱，内充液pH3时，表面电离成-SiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。,在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度电渗流。,CE中电
13、渗流的大小与方向,电渗流的大小用电渗流速度电渗流表示，取决于电渗淌度和电场强度E。即 电渗流=E电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即=00真空介电常数；介电常数；毛细管壁的Zeta电势。电渗流=0 E实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算 电渗流=Lef/teoLef 毛细管有效长度；teo电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。,CE中电渗流的流形,电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。,CE中电渗流的作用,电渗流的速度约等于一般离子电
14、泳速度的57倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：+=电渗流+ef 阳离子运动方向与电渗流一致；-=电渗流-ef 阴离子运动方向与电渗流相反；0=电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在CE中，控制电渗流非常重要。,影响电渗流的因素,1.电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。,2.毛细管材料的影响 不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；,3.电解质溶液性质的影响
15、,（1）溶液pH的影响 对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大；pH3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。（2）阴离子的影响 在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。,4.温度的影响,毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于“焦耳热”；焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；HPCE中的焦耳热与背景
16、电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。温度每变化1，将引起背景电解质溶液黏度变化2%3%；,5.添加剂的影响,（1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。,（2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，zeta电势增大，电渗流增大；（3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。,淌度,淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度；淌度不同是电泳分离的基础。1.绝对淌度(absolute mobility)ab 无限稀释溶液中带电离子在单位电场
17、强度下的平均迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。2.有效淌度(effective mobility)ef 实际溶液中的淌度(实验中测定的)。ef=aii ai 溶质i 的解离度；i 溶质i 在解离状态下的绝对淌度3.表观淌度 ap 离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）：ap=ap E,CE中的参数与关系式,1.迁移时间（保留时间）HPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。,V外加电压；L毛细管总长度；2.分离效率（塔板数）在HPCE中，仅存在纵向扩散，2=2Dt,扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。,3.分离度,影响分离度的主要因素；
18、工作电压V；毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：,影响分离效率的因素,1.纵向扩散的影响 在HPCE中，纵向扩散引起的峰展宽：2=2Dt 由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。2.进样的影响 当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度：Winj=(24D t)1/2实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%2%。,3.焦耳热与温度梯度的影响,电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：,m电解质溶液的摩尔电导；I工作电流：cm电解质浓度；散热过程中，在毛细管内形成温度
19、梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽。改善方法：（1）减小毛细管内径；（2）控制散热；,4.溶质与管壁间的相互作用,存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题。细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。减小吸附的方法和途径：加入两性离子代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的100-1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。,5.其他影响因素,（1）电分散作用对谱带展宽的影响 当溶质区带与缓冲
20、溶液区带的电导不同时，也造成谱带展宽；尽量选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。（2）“层流”现象对谱带展宽的影响 一般情况下，HPCE中不存在层流，但当毛细管两端存在压力差时，出现抛物线形的层流；产生的原因：毛细管两端液面高度不同。实际操作时，保持毛细管两端缓冲溶液平面高度相同。,毛细管电泳仪,毛细管电泳仪流程进样方式,毛细管电泳仪流程,由高压电源、毛细管柱、缓冲液池、检测器组成,1.高压电源,（1）030 kV 稳定、连续可调的直流电源；（2）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3）电场强度程序控制系统；（4）电压稳定性：0.1%；（5）电源极性易转换；,（1）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学
21、、机械性能差；（2）规格：内径2075m，外径350400m；长度=1m,2.毛细管柱,3.缓冲液池,化学惰性，机械稳定性好；,要求：具有极高灵敏度，可柱端检测；检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；,类型 检测限/mol 特点紫外-可见 10-1310-15 加二极管阵列，光谱信息荧光 10-1510-17 灵敏度高，样品需衍生激光诱导荧光 10-1810-20 灵敏度极高，样品需衍生电导 10-1810-19 离子灵敏，需专用装置；,4.检测器,毛细管电泳的进样方式,进样量：毛细管长度的1%-2%；纳升级、非常小；1.流体力学进样方式（1）进样端加压（2）出口端抽真空（3）虹吸进样,毛细
22、管一端插入样品瓶，加电压；,2.电动进样方式,进样不均：电歧视现象，淌度大的离子比淌度大的进样量大；离子丢失：淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不去；特别适合黏度大的试样；3.扩散进样 试样通过扩散作用进入分离柱端口处。,毛细管电泳分离模式,方式 分离依据毛细管区带电泳自由溶液的淌度毛细管凝胶电泳大小和电荷胶束电动色谱 与胶束间的疏水性/离 子性相互作用等电聚焦 等电点等速电泳 移动界面,毛细管区带电泳,带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；,阴离子：两种效应的运动方向相反；电渗流 电
23、泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。最基本、应用广的分离模式；,毛细管凝胶电泳,将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DAN排序的重要手段。特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。,胶束电动毛细管色谱,1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏
24、水内核、外部带负电的胶束。,在电场力的作用下，胶束在柱中移动。,2.电泳流和电渗流的方向相反，且电渗流 电泳，负电胶束以较慢的速度向负极移动；,5.色谱与电泳分离模式的结合。,3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；,毛细管等电聚焦,1.根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；2.毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（68V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸
25、性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；,4.聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；,5.阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液；6.加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；7.电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。,毛细管等速电泳,1.将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。2.负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立
26、的区带而分离。阴极进样，阳极检测。,3.不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(=E)，淌度大的离子区带电场强度小；沿出口到进口，将不同区带依次排序1、2、3、4 电场强度依次增大。假设“2”号中离子扩散到“3”号，该区电场强度大，离子被加速，返回到“2”区；当“2”号中离子跑到“1”号区，离子被减速使之归队；4.特点：界面明显，富集、浓缩作用；,毛细管电渗色谱,在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程；,高效毛细管电泳应用与进展,离子分析药物分析手性化合物分析氨基酸分析核酸分析及DNA测序新进展及热点问题,离子分析,阳
27、离子分析 迁移方向和电渗流方向一致；4.5min内分离了24种金属离子；阳极进样，阴极检测；具有很高的灵敏度；,阴离子分析,阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间长、效率低；质量小、电荷密度大的离子如：SO4-2、Cl-、F-等，电泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测；加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在3.1min内分离36种阴离子；阴极进样，阳极检测；离子价态及存在形态分析；,药物分析,检测体液或细胞中某些代谢产物的分析；尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段；采用毛细管区带电泳方式，在11min内分离17种药物；,采用M
28、EKC模式，鉴定违禁药物；效果优于HPLG法,手性化合物分析,合成获得单一手性化合物相当困难；528种手性合成药物，61中以单一对映体形式销售，其他为外消旋体；检测分析也相当困难；研究热点；R-反应停是安眠药，S-式致胎儿畸形；HPCE分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；形成配合物的稳定常数有差异，结合HPCE的高效率；常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）,氨基酸与蛋白质分析,采用MEKC模式，在25分钟内分离了23种丹酰化氨基酸；HPCE可取代传统的氨基酸分析仪；问题：吸附和检测；,蛋白质分析,核酸分析及DNA排序,重要分析手段；图，酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离；,新进展,1.微型化 整体化学分析系统（TAS）及TAS微型化 在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管，理论塔板数105/m；2.联用仪器 CE-MS；3.阵列毛细管凝胶电泳 应用于人类基因DNA测序；510万个基因，30亿个碱基对，目前最有效的DNA序列分析仪，10小时/次；可同时电泳24个样品；速度1200碱基对/小时，提高速度！100支毛细管阵列电泳；速度280碱基对/小时/支,
