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1、生化工程,姚璐晔,第三章 均相酶催化反应动力学,酶催化反应的基本特征 简单的酶催化反应动力学 有抑制的酶催化反应动力学 多底物酶催化机理,实例：脂肪酶催化酯化反应：生物柴油 油料 甘油+脂肪酸,甲醇 NaOH,生物柴油,高果糖浆：淀粉浆液,-淀粉酶,糊精,糖化酶,葡萄糖,葡萄糖异构酶,果糖,化学反应的基础知识,反应进行的方向 反应进行的可能性 反应进行的限度,化学热力学,反应进行的速率 反应机制,化学动力学,反应速率及其测定,反应速率：单位时间内反应物或生物浓度的改变。设瞬时dt内反应物浓度的很小改变为ds，则：,若用单位时间内生成物浓度的增加来表示，则：,反应分子数,反应分子数：是在反应中真
2、正相互作用的分子的数目。如：A P 属于单分子反应根据质量作用定律，单分子反应的速率方程式是：,双如：A+B C+D 属于双分子反应 其反应速率方程可表示为：,判断一个反应是单分子反应还是双分子反应，必须先了解反应机制，即了解反应过程中各个单元反应是如何进行的。,反应级数,根据实验结果，整个化学反应的速率服从哪种分子反应速率方程式，则这个反应即为几级反应。例：对于某一反应其总反应速率能以单分子反应的速率方程式表示，那么这个反应为一级反应。又如某一反应：A+B C+D,式中K为反应速率常数 符合双分子反应的表达式，为二级反应。,把反应速率与反应物浓度无关的反应叫做零级反应。,反应分子数和反应级数
3、对简单的基元反应来说是一致的，但对某些反应来说是不一致的。例如：,是双分子反应，但却符合一级反应方程式。因为蔗糖的稀水溶液中，水的浓度比蔗糖浓度大得多，水浓度的减少与蔗糖比较可以忽略不计。因此，反应速率只决定于蔗糖的浓度。,酶促反应动力学基础反应速率,零级反应,一级反应 A B,K,积分后得：,K是反应速率常数，C是积分常数若反应开始（t=0）时，A=A0,则C=lnA0，最后得到：A=A0e-kt,一级反应,二级反应 A+B C,K,K指反应的速率常数反应速率与反应物的性质和浓度、温度、压力、催化剂及溶剂性质有关,酶促反应动力学基础 平衡常数,平衡：可逆反应的正向反应和逆向反应仍在继续进行，
4、但反应速率相等。反应的平衡常数与酶的活性无关，与反应速率的大小无关，而与反应体系的温度、反应物及产物浓度有关。平衡常数（K）的计算：例：A+3B 2C+D,酶的基本概念,酶可加快反应速率降低反应的活化能（E0）不能改变反应的平衡常数K不能改变反应的自由能变化（G）酶有很强的专一性较高的催化效率反应条件温和酶易失活,酶与底物的作用机理,Lock and key Model,Induced-Fit Model,象手与手套的关系。当底物接近酶的活性中心并与之结合时，酶的构象能发生改变，更适合于底物的结合。,酶促反应动力学基础,影响酶促反应的主要因素 浓度因素（酶浓度，底物浓度，产物浓度等）外部因素（
5、温度，压力，pH，溶液的介电常数，离子强度等）内部因素（效应物，酶的结构）,酶反应动力学,酶反应动力学的两点基本假设：反应物在容器中混合良好反应速率采用初始速率,单底物酶促反应动力学,快速平衡学说的几点假设条件：酶和底物生成复合物ES，酶催化反应是经中间复合物完成的。底物浓度S远大于酶的浓度E，因此ES的形成不会降低底物浓度S，底物浓度以初始浓度计算。不考虑P+E ES这个可逆反应的存在。ES在反应开始后与E及S迅速达到动态平衡。,快速平衡学说 对于单底物的酶促反应：,由假设4可得到：,由假设3可得到产物的合成速率：,(1),(2),反应体系中酶量守恒：,由前面的公式（1）得：,代入公式（3）
6、，变换后得：,对于酶复合物ES的解离平衡过程来说，,其解离常数可以表示为，,即，,代入公式（2）得到,（3）,（4）,（5）,当反应初始时刻，底物SE，几乎所有的酶都与底物结合成复合物ES，因此E0 ES，反应速率最大，此时产物的最大合成速率为：,代入式（5）得：,式中：Vp,max：最大反应速率 如果酶的量发生改变，最大反应速率相应改变。Ks：解离常数，饱和常数 低 Ks值意味着酶与底物结合力很强。,（6）,稳态学说,1.酶和底物生成复合物ES，酶催化反应是经中间复合物完成的。2.底物浓度S远大于酶的浓度E，因此ES的形成不会降低底物浓度S，底物浓度以初始浓度计算。3.在反应的初始阶段，产物
7、浓度很低，P+E ES这个可逆反应的速率极小，可以忽略不计。4.ES的生成速率与其解离速率相等，其浓度不随时间而变化。,当反应系统中ES的生成速率与分解速率相等时，ES浓度保持不变的状态成为稳态。,Experimental data demonstrated the concentration profiles.,由于SE0，所以SES，S-ESS,根据稳态假说，,(7),(3),(8),(9),(10),式中：,Km米氏常数,Michaelis-Menten,快速平衡学说与稳态学说在动力学方程形式上是一致的，但Km和Ks表示的意义是不同的。当k+2k-1时，Km=Ks这意味着生成产物的速率远
8、远慢于ES复合物解离的速率。这对于许多酶反应也是正确的。,Mixed order with respect to S,底物浓度与反应速率的关系,反应速率、底物浓度与时间的关系,米氏常数Km的意义？,Km值代表反应速率达到Vmax/2时的底物浓度。Km是酶的一个特性常数，Km的大小只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。但底物种类、反应温度、pH能影响Km值。因此可以用Km值来鉴别酶。Km值可以判断酶的专一性和天然底物。当k+2k-1时，Km KS，那么Km可以作为酶和底物结合紧密程度的一个度量，表示酶和底物结合的亲合力大小。若已知Km值，可以计算出某一底物浓度时，其反应速率相当于Vmax的百分率。例
9、如:当S=3 Km时，代入米氏方程后可求得v=0.75Vmax。Km值可以帮助推断某一代谢反应的方向和途径。催化可逆反应的酶，对正逆两向底物的Km值往往是不同的，例如谷氨酸脱氢酶，NAD+的Km值为2.510-5mol/L，而NADH为1.810-5mol/L。测定这些Km值的差别及正逆两向底物的浓度，可以大致推测该酶催化正逆两向反应的效率。,问 题,为什么只有初始反应速率可以使用？,产物的积累使逆反应的影响不可忽略 产物可能会抑制或激活酶的活力 随着反应的进行，酶的活力可能会失活 反应体系中的一些杂质可能会影响到酶的活性,为什么说低Km值意味着酶与底物的结合力强？,考虑一下km的定义：,动力
10、学参数的求解,作图法（通过方程变换，将方程线性化）L-B法H-W法E-H法积分法非线性最小二乘法回归处理信赖域法（Matlab的优化工具箱）遗传算法（不依赖于初值，可并行计算）,L-B双倒数法,将米氏方程式两侧取双倒数，得到下列方程式：以作图,得到一直线缺点：实验点过分集中在直线的左下方，影响Km和Vmax的准确测定。,积分法,分批酶反应体系中S随时间的变化过程可以用表示为：,积分得到,或,与 对应作图，得到一直线，斜率为-Km,截距为Vm。,例1：如果要求反应速度达到Vmax的99%，求其底物浓度。解：,例2：过氧化氢酶的Km值为25mmol/L，当底物过氧化氢浓度为100mmol/L时，求
11、在此底物浓度下过氧化氢酶被底物饱和的百分数。解：,得，,即，,认为有80%的酶已与底物作用生成了中间产物，故过氧化氢酶在此时被底物饱和的百分数为80%。,例3 有一均相酶催化反应，Km值为210-3mol/L，当底物的初始浓度S0为110-5mol/L时，若反应进行1min，则有2%的底物转化为产物。试求出：（1）当反应进行3min，底物转化为产物的百分数是多少？此时底物和产物的浓度分别为多少？（2）当S0为110-6mol/L时，也反应了3min，底物和产物的浓度是多少？（3）最大反应速率Vmax值为多少？解：（1）根据题意，S00.01 Km，所以V=VmaxS0/Km=-ds/dt即，l
12、n(S0/S)=Vmax/Kmt反应进行1min时，S=（1-2%）S0=0.9810-5mol/L Vmax/Km=0.0202 min-1反应进行3min 时，ln(S0/S)=0.02023=0.0606 S=0.9410-5mol/L，XS=6%,抑制剂对酶促反应速率的影响,几个概念失活与抑制【失活】(inactivation)：由于酶蛋白分子变性而引起的酶活力丧失的现象称为失活。【抑制】(inhibition)：由于酶的必需基团化学性质的改变，但酶未变性，而引起酶活力的降低或丧失，称为抑制作用底物与效应物【效应物】(Effecter)：凡能使酶分子发生别构作用的物质叫效应物，通常为小
13、分子代谢物或辅因子。如因别构导致酶活性降低的物质称为负效应物。,竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制,可逆抑制,可逆抑制和不可逆抑制(如铅和汞等重金属)【可逆抑制】(reversible inhibition)：抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复性，这种抑制作用是可逆的，称为可逆抑制。,不可逆抑制,抑制,竞争性抑制(competitive inhibitions),抑制剂是底物的类似物,利用快速平衡假说:,和酶的浓度方程,产物速率方程,综合以上方程,消除ES得到：,where and。,The net effect of competitive inh
14、ibitions is an increasedvalue of with reduced reaction rate,but samemaximum reaction rate.,Furthermore,the competitive inhibition can be overcome by high substrate concentration.,竞争性抑制(competitive inhibitions),非竞争性抑制(Non-competitive Inhibitions),这种抑制剂能结合于酶的非活性中心，但能降低酶与底物的亲和力。,With similar equations
15、and derivations as before,Where.,we can get,The net effect of non-competitive inhibitions is a reductionin with same Michaelis-Menten constant.,High substrate concentration would not overcome non-competitive inhibitions.Other reagents need to be added to block binding of it to the enzyme.,Plots on N
16、on-competitive Inhibitions,反竞争性抑制(Uncompetitive Inhibitions),这种抑制剂仅能与ES复合物结合，而与游离酶不能直接结合。,With similar equations and derivatives as before,where and.,we can get,Plots on Uncompetitive Inhibitions,Obviously,the net effect of uncompetitive inhibitions is a reduction in both and,and the net result is a
17、 reduction in reaction rate.,各种抑制的比较,竞争性抑制,非竞争性抑制,反竞争性抑制,例 在含有相同酶浓度的五个反应物系中，分别加入不同浓度的底物，并测定其初始速率，然后再在同样五个反应物系中分别加入浓度为2.210-1mmol/L的抑制剂，并测其初始的反应速率，其数据见下表。,试根据上述数据决定其抑制类型及动力学参数值。,解：将上述实验数据分别取其倒数，以1/v-1/S作图，得到下图的两条直线，他们在纵轴上有一共同点，这表明该抑制为竞争性抑制。,Vmax=1/0.010=100 mmol/LKm=1/(0.0104/0.0026)=0.25 mmol/LKmI=1
18、/(0.0108/0.0045)=0.42 mmol/LKI=0.27 mmol/L,底物抑制(Substrate Inhibitions),高浓度的底物会抑制一些酶促反应。,With similar equations and derivations as before,变换方程得：,Then,we can get,即为,.,即,则 或,即,则 或,Discussions about Substrate Inhibitions,反应速率最大时,其底物浓度为:,低物浓度很低时,即为没有抑制剂存在情况下的米氏方程.,底物浓度很高时,底物的抑制性就很明显.,At low substrate con
19、centration,the rate expression approximates to the Michaelis-Menten equation,then the curve in double-reciprocal(双倒数)plot is parallel(平行)with the linear line denoted the instance without substrate inhibition.,Similarly,at high substrate concentration,the curve in double-reciprocal plot is in hyperbo
20、lic(双曲线)mode.,Plots on Substrate Inhibitions,产物抑制(product inhibitions),影响酶催化反应速率的因素,影响酶催化反应速率的因素有很多，它们会影响到酶的结构或化学状态。,pH对酶促反应的影响,一些酶的活性中心存在离子基团，因此,另一方面，底物分子中包含离子基团，反应体系的pH也有可能会影响到底物与酶结合的亲和力。,For CASE I(Ionic Enzyme):,The reaction scheme is as follow:,Where the meanings of the denotations are:EH:activ
21、e formE-,EH2+:inactive formE-:deprotonation form(还原态)EH2+:protonation form(氧化态),With similar analysis and derivations as before,we can get,where,考虑到酶发挥最佳的活力状态是EH，最佳pH应该是唯一的，而在最佳pH时，EH的浓度应该达到最大。,为什么酶反应的最佳pH会是在pK1和pK2之间?,因此，我们现在只要考察酶与质子H+的相互作用。,根据解离常数的定义和酶的质量守恒可得：,消除 E-和 EH2+项，可得到：,令 得到,即,For CASE II(
22、Ionic Substrate),The reaction scheme is as follow:,S,H,+,+,E,+,S,+,H,+,H,+,E,S,H,+,K,m,E,+,H,P,+,k,2,K,1,EH+,+,S,K,m,一般来说中，酶促反应的最佳pH还是很难预测的，通常需要通过实验来确定。,pH-activity profiles of two enzymes.(A)胃蛋白酶;(B)延胡索酸酶(以苹果酸为底物时),温度对酶促反应的影响,在较低的温度范围内，酶催化反应速率会随着温度的升高而加快，超过某一温度，即酶被加热到生理允许温度以上时，酶的反应速率反而随着温度的升高而下降。,这
23、是由于温度升高，虽然可加速酶的催化反应速率，同时也加快了酶的热失活速率。,温度激活作用(上升区),酶催化反应速率常数中的k2与温度的关系符合Arrhenius方程:,即,式中 E 活性酶的浓度;Ea 是反应活化能(kcal/mol).R 是气体常数 T 是绝对温度，A是前因子,热失活作用(下降区),(酶的热变性作用),酶的热变性失活符合一级反应动力学方程：,此外,式中 Ed is the denaturation energy(kcal/mol).,例2-1：将底物和酶加入到分批式反应器中，底物初始浓度为2mmol/L，经反应，转化率为90%，求反应所需的时间t。已知反应速率方程为:,解：在分
24、批式反应器中,即：,积分得到：,转化率为90%，即(S0-S)/S0=0.9,S=0.2,例2-2：假设某酶有两个活性中心，它的反应机制可用下图表示，试根据稳态假设，求其速率方程式,解：根据解离平衡过程可得,根据酶的质量守恒可得,将上面两式变换后可得,变换方程可以得到以下两式：,当反应速率达到最大时，所有的酶都以复合物的形式存在，则 E0=ES+ESS,Vmax=k+2(ES+ESS)=k+2E0,例2-3：某酶催化反应，其Km=0.01 mol/L,现测得该反应进行到10 min时，底物浓度为3.410-5 mol/L,已知S0=3.410-4mol/L.假定该反应可用M-M方程表示。试求：
25、(1)最大反应速率是多少?(2)反应20min后，底物浓度为多少？,解：已知米氏方程及题中条件知S0Km则米氏方程可表示为,10 min时,S=3.410-5,代入上式可得：Vmax=(0.01ln10)/10=0.0023 mol L-1 min-1当t=20 min,lnS=lnS0-Vmaxt/Km=ln(3.4X10-4)-0.0023X20/0.01 S20min=3.42X10-6 mol/L,Two-Substrate Reactions,Random sequential mechanisms(随机机制)Ordered sequential mechanisms(顺序机制)Pi
26、ng-Pong mechanisms(乒乓机制),所有底物(A和B)与酶结合后，反应才能发生；各底物与酶的结合次序及产物与酶的释放次序是随机的。,I.Random sequential Bi Bi mechanisms,反应,底物A,B与酶E结合,产物P,Q从酶的结合点释放,I.Random sequential Bi Bi mechanisms,Bimolecular substratesBimolecular products,A useful relationship exists among above constants,Rearrangement,(a),Relationship
27、of v and A,From eq(a),then,Relationship of v and B,Fixed substrate concentration dependence for enzymes displaying randomsequential mechanisms.,Dependence of Vmax on A,Dependence of K on A,Dependence of Vmax on B,Dependence of K on B,II.Ordered sequential Bi Bi mechanisms,所有底物(A和B)与酶结合后，反应才能发生；各底物与酶
28、的结合及产物与酶的释放是按一定次序进行的。,Rearrangement,Relationship of v and B,Relationship of v and A,Fixed substrate concentration dependence for enzymes displaying ordered sequential mechanisms,dependence of Vmax on B,dependence of K on B,dependence of K on A,底物A和B始终不能同时与酶结合;至少有一个产物在所有底物完成反应之前从酶的结合位点释放.,反应,A与E结合,P与
29、E释放,B与E结合,反应,Q与E释放,生成产物P,生成产物Q,III.ping-pong Bi Bi mechanisms,A relationship between E and E can also be obtained,assuming a steady state in the concentration of E,then,Relationship of v and B,where,and,Fixed substrate concentration dependence for enzymes displaying ping-pong mechanisms,dependence o
30、f Vmax on B,dependence of K on B,Fixed substrate concentration dependence for enzymes displaying ping-pong mechanisms,Relationship of v and A,where,and,dependence of Vmax on A,dependence of K on A,Differentiation Between Mechanisms,Relationship of the K and A or B,思考题,1.某一酶催化反应的Km值为4.710-5mol/L，Vmax
31、=22mol/(Lmin)，S=210-4mol/L，I=510-4mol/L，KI=310-4mol/L，试分别计算在竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制三种情况下的反应速率。,思考题,2.Scott等提出乳糖在乳糖酶存在时水解机理如下：E+S ES E+P+Q E+P EP式中 S、P、Q分别为乳糖、半乳糖和葡萄糖。（1）用稳态法推导半乳糖生成的速率方程。（2）判断半乳糖对此反应是竞争性还是非竞争性抑制？,K+1,K-1,K+2,K+3,K-3,思考题,3.下列反应为一有产物抑制的酶催化反应：E+S ES E+P EP ES+P ESP EP+S EPS ES E+P（1）根据平衡假设，推导其速率方程；（2）如果ESP=EPS，推导的方程如何简化？（3）如果存在k-1/k+1=k-4/k+4和k-2/k+2=k-3/k+3的关系则由（2）求得的方程中最大速率和米氏常数如何表示？,K+1,K-1,K+2,K-2,K+3,K-3,K+4,K-4,K+5,
