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1、ZFN 技术原理,锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases,ZFN）是人工改造的限制性核酸内切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。,锌指结构中每一个螺旋可以特异识别3-4个碱基；人工设计识别特异DNA序列的螺旋采用如上的通用序列，通过改变其中7个X来实现识别不同的三联体碱基，TGEK是多个螺旋间的连接序列；构建成对人工锌指结构域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定区域切断DNA双链。,ZFN 技术,锌指核酸酶介导的定向染色体删除,研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑，比如基因敲除。已建立有ZFN库，识别多种DNA序列，但还不能达到识别任意靶D
2、NA的目的，其应用受到一定的限制。,崭新的技术-TALEN经典的挑战 染色体DNA序列的人工编辑修改（点）突变：Silent；Missense；Nonsense；Frame shift（基因敲除，Knockout）片段删除 片段插入目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗,崭新的技术解决经典的挑战,靶向基因技术,经典方法：自杀质粒，同源重组 几率低(1 HR event per 106 cells），难！饱含希望与失望的技术：ZFN，被Sigma公司垄断新的里程碑：TALEN,TALEN技术,基于TALEN(transcription activator-like(TAL)effector n
3、ucleases)的靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大鼠等各类研究对象。技术原理：表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶识别靶点核酸序列，并发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基因敲除的过程。,1989年 植物病原体黄单胞菌属（Xanthomonas spp.）avrBs3 基因被克隆。2007年 发现其序列特异性核酸结合特性，avrBs3 TA2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译 由34个aa组成一个单元模块，重复17-18次 34个aa中的第12和13个氨基酸（Repeat Variant
4、Di-residue,RVD)对应识别一个目标碱基,TALEN 发展过程,人工构建TALE模块识别指定核酸序列,102碱基模块单元,14 18个重复,真核表达,特异识别指定的14-18 个核酸序列并与之结合,34氨基酸单元,TALEN 发展过程,TALEN(TALE+FOK I)表达质粒对,TALEN 基因敲除,X 2,TALEN 表达质粒对转染、表达切割靶位点,切割诱发DNA损伤修复机制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生移码突变错误的个体即形成目标基因敲除突变体,TALEN介导的同源重组,同源重组发生率升高几
5、个数量级,HR,Left arm,Right arm,Left arm,Right arm,点突变,片段删除,基因敲入,2011年8月，Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。一篇人类干细胞 Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases 一篇大鼠Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs 两篇斑马鱼 Targeted gene disruption in so
6、matic zebrafish cells using engineered TALENs Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs 一篇综述Move over ZFN,TALEN的最前沿,TALEN靶向（基因敲除）技术基本流程,选择、确定靶点2.TALE识别模块串联构建3.TALEN真核表达质粒构建4.TALEN真核表达质粒转入（卵）细胞，表达TALEN重组蛋白5.检测突变效率，筛选（移码）突变体,X 2,X 2,X 2,靶点的DNA序列特征：相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点参考文献：Cerm
7、ak et al.,Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting,Nucleic Acids Research,2011,Vol.39,No.12,e82.在线靶点选择设计软件：https:/boglab.plp.iastate.edu/node/add/talef-off/,选择确定TALE靶点,TAL的核酸识别单元为34aa模块中的双连氨基酸（RVD）RVD与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NI识别A，NG识别T，HD识别C，N
8、N识别G，非常简单明确 欲使TALEN特异识别某一核酸序列（靶点），只须按照靶点序列将相应TAL单元（14-18个）串联克隆即可。,TALE识别模块串联构建,具专利保护的克隆构建系统,具专利保护的克隆构建系统,步骤一：靶点识别单元串联,步骤二：TALEN表达质粒构建,具专利保护的克隆构建系统,将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含有TAL的其它必需结构域并在C端融合有FokI序列。目前，TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因。因FokI需形成2聚体方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔
9、17碱基）的靶序列（14-18个碱基）分别进行TAL识别模块构建。,X 2,真核表达TALEN质粒对,步骤三.将TALEN质粒对共转入细胞中实现靶基因敲除TALEN质粒对共转入细胞后，其表达的融合蛋白即可分别找到其DNA靶位点并与靶位点特异结合。此时，两个TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，于两个靶位点之间打断目标基因。,FOKI 内切酶打断靶点区,内切酶的切割诱发DNA损伤修复机制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生移码突变错误的个体即形成目标基因敲除突变体。,突变体形成,P
10、CR 酶切法 利用靶点设计时挑选的，位于相邻靶位点之间的特异性内切酶位点，进行PCR产物酶切鉴定。当左右靶点之间没有合适的酶切位点时可使用CEL-I核酸酶检测。经验规律：=2%可用，=10%很好,TALEN切割效率检测,TALEN切割效率检测,启动子 ABCDEF stop-Target site-DEFHIJK,启动子 ABCDEFHIJK,共转染荧光素酶检测质粒+TALEN质粒 1+TALEN质粒 2,荧光素酶检测法,发光倍数与切割效率之间的定量关系尚缺乏充分研究。有文献表明，发光倍数达1.5至2倍即可有效获得突变体。,突变体筛选,有限稀释法获得单细胞克隆 PCR-酶切法鉴定 PCR测序确
11、认,基本工具质粒,14 18bp靶点序列,怎样做TALEN,1单元模块质粒：A，G，C,T共4种2单元模块质粒：4X4=16种TALEN表达载体：基于PCS2质粒2种,怎样做TALEN,怎样做TALEN,TALEN技术成功率影响因素,重组TALEN模块与靶位点的 亲合力靶点序列设计原则来自20个天然TLAE的统计规律细胞系固有特性K562容易，293中等，MC-10困难细胞转染效率不同细胞系转染效率不同，293高，HeLa低所期待的目标Heterozygous？Homozygous？Exact point mutation？Selection marker insertion？,TALE技术应
12、用范围,细菌：尚无报道，已另有多种高效靶向技术。真菌：有报道，TALE原理可行。植物：TALE原理发现于植物，需特定转基因技术。动物细胞：TALE原理可行，各细胞系效率不一。斑马鱼：有TALEN基因敲除报道，尚无点突变与敲入报道。小鼠、大鼠原理肯定可行，但尚无报道（技术太新，转基因动物构建实验周期较长）。TALEN应用扩展的技术关键：切实可靠的表达系统。高效的转基因及克隆筛选技术。,TALEN的植物应用,Ting Li et.al.High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease resistant rice，volume 30
13、 number 5 may 2012 Nature Biotechnology 背景水稻病原菌 Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)导致细菌性白叶枯病。细菌天然 TALE AvrXa7 or PthXo3 与水稻Os11N3基因 启动子结合，调控（hijack）此基因上调表达，促进细胞内糖份向细胞外转运，便于病原菌利用。策略以TALEN对细菌TALE靶点区做突变，使细菌TALE无法与水稻Os11N3基因 启动子结合。结果突变水稻获得抵御细菌感染的能力,TALEN与主要类同技术比较,siRNA优于TALEN可瞬时转染快速观察效果Knockdown效果确实，可用于必须
14、基因逊于TALEN瞬时转染效果短暂不是彻底knockout慢病毒稳转发生染色体随机整合ZFN优于TALEN经验积累多，技术较成熟逊于TALEN技术复杂，难度高，被Sigma公司垄断靶点序列要求高，难找Off-targeting现象严重经常有显著细胞毒性,基因组精密工程,今年来自梅奥医学中心的研究人员第一次利用人工酶切割一段基因序列中的部分DNA，并用合成DNA取代它们，对斑马鱼基因组部分序列进行了定制修改。这种技术称为转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）方法，相比ZFNs和 morpholin
15、os，TALENs具有几个优势：它们更便宜、更有效，尤其是以一种开发活性形式应用时。ZFNs只能靶向特异序列，而TALENs有潜力对任何的DNA序列起作用。Morpholinos的效应是短暂的，而TALENs可造成永久性的改变。随后科学家们在蟾蜍等其它动物中展开了这方面的研究，证明这种技术与已证实的基因靶向技术一样有效。国内清华大学的施一公和颜宁等人也于今年在Science杂志上报道了TALE特异识别DNA的分子机理，这提供了TALE蛋白的改造基础，极大地拓宽了TALE蛋白在生物技术应用上的前景。,新技术介绍,CRISPR-Cas系统基因修饰技术,Biotechnology:Rewriting
16、 a genomeNature495,5051(07 March 2013)doi:10.1038/495050a,1 CRISPR-Cas概述,1987年，日本大阪大学（Osaka University）在对一种细菌编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的两端还存在一段不太长的特有的序列。2013以后，研究者们在包括science和nature biotechnology等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马
17、鱼等物种上实现精确的基因修饰。,1 CRISPR-Cas概述,CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。,CRISPR-Cas主要由两部分组成：,识别,切割,1 CRISPR-Cas概述,1.1 CRISPR结构,CRISPR：（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）CRISPR 是一个特殊的DNA重复序列家族,广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats)组成,重复序列的长度通常 2148 bp,重复序列之间被
18、2672 bp 间隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（space）与靶基因进行识别。,1.1 CRISPR结构,1.2 Cas家族,Cas（CRISPR associated）：存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。,2 CRISPR-Cas系统的发现,CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。,2 CRISPR-Cas系统的发现,2 CRISP
19、R-Cas系统的发现,2 CRISPR-Cas系统的发现,CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫,而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了CRISPR 介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由CRISPR 间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列（spacer）来实现的。,2 CRISPR-Cas系统靶向要求,最主要的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）为NGG。,2 CRISPR-Cas系统靶向要求,在人类基因组中，平均每8bp就出现一个NGG PAM。,2 C
20、RISPR-Cas系统靶向要求,3 CRISPR-Cas系统介导基因修饰,3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换,2013年1月29日在nature biotechnology上发表的RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems一文中，作者利用CRISPR-Cas系统用设计好的DNA模板替换的相应基因来达到基因的定向修饰。,3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换,3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰,2013年1月29日在nature biotechnology上发表的efficient
21、 genome editing in zebra fish using a CRISPR-Cas system一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进行修饰。,3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰,3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰,3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰,Cas9,sg-RNA,2013年2月15日在science上发表的Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems一文中，作者利用一个包含两个靶向不同基因的spacers的crRNA实现了同时对两个基因进行编辑。
22、,3.3 cr-RNA：Cas介导双基因修饰,3.3 cr-RNA：Cas介导双基因修饰,4 CRISPR-Cas系统前景分析,这是一项靶向基因修饰的革新技术，一项极具有可能获得诺贝尔奖技术。,4 CRISPR-Cas系统前景分析,2013年4月12日在cell stem cell上发表的Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs一文中，作者利用TALENs和CRISPRs对同一基因进行修饰，效率分别为0%-34%和51%-79%。,4 CRISPR-Cas系统前景分析,而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。,4 CRISPR-Cas系统前景分析,只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构建TALENs和ZFNs更简单方便。较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复的TALENs编码载体带来的并发症。,技术优势,
