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1、基因的克隆,基因工程,基因的克隆-重组技术。克隆：是用无性繁殖的方法产生一组遗传上相同的细胞或生物群体的过程，而这些细胞或个体均来自无性繁殖的单一原型细胞。基因的克隆:用重组技术使一个基因或片段产生出很多相同拷贝的过程。,目的基因的表达,连接产物导入受体细胞,目的基因与载体连接,获取目的基因,得出结论,步骤三：,步骤二：,步骤一：,基因克隆的技术路线的大体步骤,一、获取目的基因,从染色体中获得目的基因 1.基因组DNA的随机断裂片段 2.限制性内切酶切割基因组DNA 3.用反转录法合成cDNA人工合成PCR扩增特定的目的基因片段,基因克隆的载体,载体满足的几个要求：1.分子相对较小（310Kb
2、）能进行复制且具有高度拷贝数 2.具有几个单一的酶切位点，便于所要DNA片段能够连接、插入载体，酶切位点应该在载体复制子意外适当的位置。3.外源性DNA插入后，载体在受体细胞中的复制不受影响。4.载体本身应对受体细胞无害，以及能接纳尽可能大的外源性DNA片段。5.有便于筛选的明显标志，以便于阳性克隆细胞容易被选出 6.具有促进外源性DNA表达的调控区。7.生物防护安全，不污染环境。,载体的种类,质粒 1.大肠杆菌质粒 2.革兰氏阳性菌的质粒噬菌体真核细胞为宿主的克隆载体 1.酵母为宿主的载体 2.植物细胞为宿主的载体 3.DNA病毒载体反转录病毒载体,大肠杆菌的质粒,pBR322质粒：它是由4
3、361个核苷酸组成，属于松弛型质粒，可以用抗氨苄西林和抗四环素基因作为标记，具有多种常用内切酶的切点。,pBR322克隆DNA片段的程序,质粒作为基因克隆载体应注意：,质粒的选择：质粒应具备完成实验目的所需的基本结构，如启动子、顺序、终止信号、分泌信号等。其次是质粒DNA上应具备能满足重组用的内切酶位点。酶切DNA片段末端的考虑：酶切后形成的DNA片段末端有黏性末端和平末端。在插入片段和载体片段末端之间连接时会出现：两个不同黏性末端的连接和两个相同黏性末端连接；一个黏性一个平末端和两个平末端连接。载体的自身环化：有时发生酶切过的线性载体DNA在酶的（T4DNA）催化下，线性载体DNA两黏性末端
4、会重新连接。可以通过调整插入片段与载体之间的浓度，在一定程度上可以减少这种现象。也可以通过磷酸酯酶处理线性载体DNA。,以植物细胞为宿主的基因克隆载体,主要应用Ti质粒（根瘤土壤农杆菌），由于Ti质粒的宿主广泛，其T-DNA可以整合到植物细胞中，同时冠瘿氨基酸合成酶基因启动子能整合到染色体中，因此Ti质粒作为基因工程的载体：1.在体外将从Ti质粒中切割下的T-DNA插入到另一种质粒中，再用内切酶切开T-DNA，在T-DNA片段中冠瘿氨基酸合成酶启动子下游处插入外源性基因形成重组子。2.分别用野生型ti质粒和上步中的重组子来转化根瘤土壤农杆菌。3.在菌体内因为重组子中的T-DNA和野生型Ti质粒
5、中的T-DNA有同源性会发生同源重组、等为交换，从而使野生型Ti质粒携带了外源性基因。,4.含有外源性基因的野生型Ti，可随根瘤土壤农杆菌感染植物而进入到细胞内，同时可随T-DNA一起整合到植物宿主细胞的染色体中。5.在冠瘿氨基酸合成酶基因启动子作用下，进行高效率表达，同时T-DNA中抑制植物分化的作用被外源性基因的插入而削弱，从而使植物正常分化。,目的基因与载体的连接,黏性末端和平末端：a：沿着中轴线切口（即沿着DNA双链中对应的磷酸二酯键）切开，得到的就是两个平末端。b：在中轴线的两端切口切开，得到的就是两个黏性末端。例如:EcoRI限制性内切酶就可以识别G/AATTC的DNA序列，然后在
6、G和A间切开，得到的就是两个黏性末端。（之间可以根据碱基互补配对原则重组）限制酶的切口不都是一长一短的,一长一短的叫黏性末端,一样长的叫平末端。,黏性末端和平末端：,黏性末端的连接：,单酶切黏性末端的连接,双酶切黏性末端的连接,平末端的连接（转化成黏性末端）,由于连接平末端DNA片段时，所需底物浓度高，且连接效率低。所以一般需要进行修饰或改造形成黏性末端后再进行连接。,图为人工接头连接法,利用适配子来重组DNA分子,连接产物导入受体细胞（细菌）,氯化钙法将其导入受体细胞：利用氯化钙和热休克使受体菌成为感受态细胞，促进外源 DNA进入。感受态细胞：宿主细胞与重组DNA在0摄氏度的氯化钙溶液中孵育
7、，快速转入42摄氏度造成热休克。经此处理后的细胞“容易”接受外源基因，一般叫做感受态细胞。处于感受态的细菌表面正电荷增加，细胞膜的结构有改变，通透性增强，转化子易于进入细胞。,连接产物导入受体细胞（真核细胞）,借助于载体的基因转移：主要是以重组的动植物病毒、反转录病毒及侵染植物的农杆菌Ti质粒直接传染受体细胞，把外源基因引入。不需借助载体的基因转移：1.磷酸钙沉淀法 2.脂质体介导法 3.血影细胞介导法 4.电穿孔转移法,磷酸钙沉淀法的原理：将转移基因的DNA溶液与适量的氯化钙溶液混合，再加入一定量的磷酸盐溶液，逐步生成磷酸钙-DNA沉淀复合物。将适量的沉淀复合物加入到细胞培养液中，通过细胞的
8、胞饮作用进入到细胞质或进而转移到细胞核中，然后整合到染色体上。脂质体介导法:脂质体是磷脂在水中形成的一种有脂类双分子层围成的囊状脂质小泡结构，其外周是脂双层，内部是水腔。它可以与 DNA 分子通过静电结合或直接把 DNA 分子包裹在其内，并通过细胞膜把基因运送到细胞内，实现外源基因的有效转染。,血影细胞介导法:血影细胞是指哺乳动物的红细胞在机械作用、病毒诱导、低渗等条件下发生溶血且使血红蛋白大量溢出，最后形成仅有被细胞膜包被的细胞结构。在溶血过程中由于外界的作用使细胞膜的通透性加强，不仅血红蛋白溢出，外源基因也容易进入；当外界条件发生改变后，红细胞膜又可以恢复原来的选择通透性。外源基因血影细胞
9、受体细胞融合基因导入电穿孔转移法：在一定强度的脉冲电压刺激下，细胞膜发生临时性破裂而形成微小洞，从而导致外源基因通过细胞膜 进入细胞内实现外源基因的转移。,重组子的筛选与鉴定,几种常用的重组分子的筛选方法：抗药性标记插入失活标记法半乳糖苷酶显色反应筛选法原位杂交免疫法筛选,抗药性标记插入失活标记法,目的基因插入到抗四环素基因的位置，则导入菌体后的菌株则不能在有四环素的培养基上生长,半乳糖苷酶显色反应筛选法,多克隆位点,完整的LacZ基因内，经过改造加入了多克隆位点，但并不影响LacZ基因的表达。,当质粒转化细胞后，完整的LacZ基因表达产物与细菌的有关基因表达产物共同组成有功能的半乳糖苷酶，该
10、酶把无色的X-gal切割成半乳糖和蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝，使得菌落呈现蓝色。,X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷,表示外源基因插入编码半乳糖苷酶的基因区段,带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落,使用含Amp+X-Gal的琼脂糖平板筛选克隆，可能出现三种情况。1.载体自身环化，产生蓝色菌落；2 带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落。3 未转化的细胞，不能生长。,对照目的基因本身不能是培养基变色,原位杂交,生长在琼脂糖平板上的菌落，可定点转移到硝酸纤维素膜上，加入放射性的探针（即带有 放射性的与目的片断互补的核酸片断），与菌落杂交。经洗涤后的膜与X光胶片作用，挑选出
11、阳性克隆。,免疫法筛选,原理 目的基因编码的蛋白质作为抗原，用特异性抗体与之反应，再根据颜色等变化，筛选出菌落。方法 在琼脂平板上的菌落，转移到尼龙滤膜上，若某菌落带有目的基因，并可表达该目的基因所编码的蛋白质，则加入该蛋白质的特异抗体，可与该菌落结合，附着在滤膜上，不会被洗掉。该抗体可携带酶或荧光，易于检测。,基因表达产物的鉴定,基因表达：指某基因在细胞中转录为mRNA继而翻译成蛋白质的过程。,研究基因表达的手段,1、RT-PCR(RNA)2、Northern blot(RNA)3、Western blot(蛋白质）4、免疫组化（蛋白质）,1、RT-PCR,基本原理：将细胞中mRNA逆转录为
12、cDNA，以cDNA为模板，进行PCR反应。根据PCR产物的量，判断基因表达的强度。,2、Northern blot,标记探针与膜固相RNA杂交。根据杂交信号强弱判断表达量，根据杂交信号位置判断分子长度。,实验操作：1）RNA提取2）RNA电泳（分离不同长度RNA)3）转膜(形成固相RNA)4）探针标记（同位素/非同位素）5）杂交6）洗膜7）显影（放射性/酶促反应）优点：因为没有扩增过程，Northern blot 的结果可靠性高。可以确定未知基因的转录产物（mRNA）长度。缺点：1、操作烦琐2、使用同位素可能污染环境3、灵敏度低4、对RNA质量要求高,、Western blot,标记抗体与固定在膜上的蛋白作用。根据信号强弱判断蛋白表达强度。根据信号位置判断蛋白分子量。,标准分子量蛋白,特异性反应带,优点：直接检测蛋白质的表达量。缺点：灵敏度低一抗制备难度大，购买价格高,氨基酸序列测定,测定N端的1015个氨基酸测定C端的5个氨基酸样品需精制价格较高,谢谢大家,
