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1、,大肠菌群的测定,大肠菌群:一群能发酵乳糖,产酸产气,需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌.,分布：分布较广，多存于温血动物粪便，人类粪便中或者被其污染的地方,测量意义：该菌源于粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中是否有污染肠道致病菌的可能.,检测方法,国家标准检验方法（乳糖发酵法）,原理：1 一群能发酵乳糖,产酸产气,需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌.2 大肠菌群在36oC+2oC能在有胆盐存在下生长,MPN:最大可能数的简称.表示样品中活菌的密度.是用概率论来推算样品中菌数近似的数值.常用的单位:涂抹大肠实验-MPN/100cm2 液体大肠实验-MPN/100m
2、l 固体大肠实验-MPN/100g 大肠空白没有单位,不用出结果,大肠菌群检验步骤,大肠菌群的检验步骤为检样稀释.依据国标 检样稀释 初发酵(乳糖发酵)五步 分离培养 证实实验(复发酵)结果报告,大肠菌群检测流程图,A.检样稀释,1)-以无菌操作将检样25g/ml接种在装有 225ml灭菌生理的盐水或其它稀释液的灭菌玻璃瓶内.充分混合,制成1:10的均匀稀(2)-用1ml灭菌吸管,吸取1:10稀释液注人含有9ml灭菌生理的盐水或其它稀释液的灭菌试管内,混匀,制成1:100稀释液,无菌取样,样液稀释,B.初发酵(通常说的假定试验,目的在于检查样品中有无发酵产气的细菌),将待检样品接种于乳糖胆发酵
3、管内.接种量在1ml以上者,用双料管,1ml 及1ml以下者,用单料管.每一种稀释液接种3管.,10*0.1,双料l,双料,双料,单料,单料,单料,单料,单料,单料,盐水,1*0.1,1*0.01,1ml,0.1ml,0.01ml,0.01,0.1,稀释液,361OC培养箱内.培养2412h 如发酵都不产气,则报告大肠阴性如发酵有产气进行下步试验,C.分离培养,将产气的样品接种伊红美兰培养基上,361OC培养箱内培养,1824h 观察菌落形态,并做革兰氏染色证实实验 菌落形态:深紫黑色,具有金属光泽的菌落 紫黑色,不代或略带金属光泽的 菌落 淡紫黑色,中心色较深的菌落(可疑菌落)粉红色,中心色
4、无较深的菌落,倒平板,熔化已灭菌的培养基并冷却至45左右倒平板，每种培养基每个稀释度各三只平板。,菌落类型,D.证实实验(复发酵),在上述平板上,挑选典型菌落接种在乳糖发酵管中,置361oc培养箱内,培养242h,观察产气情况.凡乳糖产气,革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,即可报告为大肠菌群阳性.,注意事项,(1).初发酵和证实试验:乳糖发酵实验系样品发酵,不是纯菌的发酵实验,所以初发酵阳性并不代表大肠菌群阳性,因此,必须做进一步证实实验.(2).产气量与倒气管:用于初发酵或复发 酵的导气管内应无气泡,作空 白对照 应以产气为主,产酸仅作参考 导气管口被样品颗粒封住,影响结果,3)挑选菌落:在平板
5、呈黑色,有或无金属光泽,检出率最高,粉红色,粉色检出率最低.只挑选一个菌落影响大肠菌群的检出率,当菌落不典型时,应挑选23个菌落作证实试验,以免出现假阴性.(4)MPN检索表:本表采用3个稀释度,即1ml(g),0.1ml(g),0.01ml(g)若改用10ml(g),1ml(g),0.1ml(g)时,表内数字应相应降低10倍.若改用0.1ml(g),0.01ml(g),0.001ml(g)时,表内数字应相应增加10倍.,快速测定方法,最可能数法平板法,步骤与乳糖法相似。培养条件相同,最可能数（MPN)法,原理：大肠菌群可产生-半乳糖苷酶。分解液体培养集中的酶底物MUGal,使4-甲基伞形酮游
6、离，在336nm的紫外光灯下呈现蓝色荧光。可根据产生状况结合MPN表对大肠菌群进行测定,平板法,原理：大肠菌群可产生-半乳糖苷酶。分解液体培养集中的酶底物 Aliz-gal，使茜素有了并与固体培养基中的铝 铁 钾 铵离子结合形成紫色（或红色）络合物，使菌落呈现相应颜色,计数,当平板上的紫色（或红色）菌落不高于150个，且其中至少有一个平板紫色（或红色)菌落不少于15个则可按下式计数,快速测定流程,检样,稀释,MUGal肉汤（MPN)法,336nm紫外灯下暗处观察,有荧光,无荧光,阳性,阴性,报告,Aliz-gal琼脂（平板法）,报告,计数紫色（或红色）菌落,其他检验方法,LTSE快速检测法疏水网膜法TTC显色法DC(去氧胆酸法)半固体试管法纸片法显色荧光法PCR法,
