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1、实验三 细菌的简单染色和革兰氏染色,细菌的简单染色和革兰氏染色,一 目的要求 二 基本原理 三 实验材料 四 无菌操作过程 五 操作步骤 六 实验报告 七 思考题,一 目的要求,1 学习制染色片技术，学习简单染色革兰氏染色原理，理解着色机理。学习并掌握无菌操作的技术。3 掌握简单染色革兰氏染色的方法，并能正确染色4 巩固显微镜油镜的使用方法。,（一）细菌的简单染色原理（二）革兰氏染色基本原理,二 基本原理,细菌细胞微小，且含水量较多，在普通光镜下表现为无色透明，不易观察，所以必须进行染色处理，使细胞着色，便于观察。简单染色是使用单一染料染色，可用于观察细菌形态、大小、及排列方式.染色前一般要将
2、细胞固定，其目的是杀死菌体并使之粘附于玻片上，还可以增强菌体的着色能力。固定有加热法和化学法两种，无论采用何种方法均应维持细胞原有形态。,（一）细菌的简单染色原理,（二）革兰氏染色基本原理,革兰氏染色是用于细菌鉴别的一种重要染色方法。它是根据革兰氏阳性细菌、阴性细菌细胞壁结构、组成的不同而使用一系列的染色处理使之差别显色。其染色方法是先将细菌分别用结晶紫和碘液初染媒染后，乙醇脱色，再经复染剂复染。最终被染成红色的是革兰氏阴性细菌；被染成紫色的是革兰氏阳性细菌。,革兰氏染色原理：第一步：结晶紫使菌体着上紫色第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内。第三步：酒精脱色，细胞
3、壁成分和构造不同，出现不同的反应。G+菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。G菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，蕃红复染后呈红色。,1,2,3,4,？,三 实验材料,大肠杆菌（24 h 培养）斜面菌种枯草杆菌（16 h 培养）斜面菌种,四 无菌操作过程,无菌操作：不让除我们接种的微生物以外 其它微生物侵入的技术。,（一）简单染色操作步骤,涂片：载玻片 无菌水 斜面菌种 无菌操作 均匀的
4、薄层2 干燥：3固定：加热固定,五 操作步骤,4染色：结晶紫染1min 或蕃红染2-3min 或石炭酸复红 染1min。5水洗：6 干燥：7镜检：低倍镜观察以确定目标和范围，再换用油镜观察绘图。,（二）革兰氏染色操作步骤,1涂片：方法同单染色，然后干燥、固定。2初染：滴加结晶紫染色1min，后用水冲洗。3媒染：滴加碘液染色1-2min，后用水冲洗，甩尽残余水4脱色：用95%乙醇冲洗30秒（需要严格控制时间和浓度），然后立即用水冲洗。5复染：用蕃红或石炭酸复红覆盖涂片进行复染，蕃红染 2-3min，如果石炭酸复红染1min。水洗，晾干。6镜检：先用低倍镜观察，后用油镜观察,1,2,3,4,六 实验报告,写出实验目的2 写出简单染色、革兰氏染色的基本原理根据实验结果绘出简单染色和革兰氏染色的结果图。思考题：A如果对一未知菌进行革兰氏染色，如何能确证染色结果正确可靠？C为什么说95%酒精脱色是革兰氏染色的关键步骤？,下次实验内容：实验四 微生物细胞大小的测定及显微镜下直接计数,菌名：放大倍数：,细菌简单染色结果图,细菌革兰氏染色结果图 要求：标出菌名、颜色、阳性或阴性菌,放大倍数：,
