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1、第二章 微生物的代谢育种,鲁东大学生命科学学院,新陈代谢：发生在活细胞中的各种分解代谢（catabolism）和合成代谢（anabolism）的总和。新陈代谢=分解代谢+合成代谢新陈代谢具有三大特点：1）生物反应都在温和条件下进行，大多为酶所催化2）反应都有顺序性3)具有灵敏的自动调节机制,代谢概论,复杂分子（有机物）,分解代谢,合成代谢,简单小分子,ATP,H,第一节 代谢调节方式,代谢途径区域化代谢流向的调控代谢速度的调控细胞透性的调节,酶量（粗调）酶活（细调）,酶合成的诱导酶合成的阻遏,酶活性的激活酶活性的抑制,1、代谢途径区域化,原核微生物细胞虽然没有复杂的具有膜结构的细胞器，但也划分
2、出不同的区域，对于某一代谢途径有关的酶系集中在某一区域，以保证这一代谢途径酶促反应的顺利进行，避免了其他途径的干扰；真核微生物细胞里，各种酶系被细胞器隔离分布，使其代谢活动只能在特定的部位上进行，如与呼吸产能有关的酶系集中于线粒体内膜上，DNA合成的某些酶位于细胞核里。,2、代谢流向的调控,微生物在不同条件下可以通过控制各代谢途径中某个酶促反应的速率来控制代谢物的流向，从而保持机体代谢的平衡。,由一个关键酶控制的可逆反应 同一个酶可以通过不同的辅基（或辅酶）控制代谢物的流向；,谷氨酸脱氢酶+NADP+催化谷氨酸的合成,谷氨酸脱氢酶+NAD+催化谷氨酸的分解,由两种酶控制的逆单向反应 在生物体代
3、谢的关键部位的某些反应，是由两种不同的酶来催化的。即在一个“可逆”反应中，其中一个酶催化正反应，另一种酶则催化逆反应。如：葡萄糖+ATP 6-磷酸葡萄糖6-磷酸葡萄糖+H2O 葡萄糖+Pi,己糖激酶,6-磷酸葡萄糖酯酶,微生物体内利用两种完全不同的酶，能十分精确地控制正反应和逆反应。,3、代谢速度的调控,（1）酶合成的调节（粗调）,通过酶量的变化来控制代谢的速率。从本质上看，酶合成的调节是在基因表达水平上起作用的。,酶合成的诱导（induction of enzyme synthesis）协同诱导：一种诱导剂可以同时诱导产生若干种酶的现象。顺序诱导：一种诱导剂诱导产生的酶的反应产物可继续诱导产
4、生下一个酶，这种连续诱导产生一系列酶的现象称为顺序诱导。,酶合成的阻遏（repression of enzyme synthesis）终点产物反馈阻遏：合成代谢过程中，相关酶的合成被过量终点产物所阻遏。分解代谢物阻遏：可被组成酶快速利用的基质，阻遏了分解难利用基质的酶的合成。,（1）酶合成的调节（粗调）,酶合成调节的遗传机制：操纵子学说,（1）酶合成的调节（粗调）,操纵子是指基因组DNA分子的一个片段，这个片断由启动子、调节基因、操纵基因和结构基因组成。诱导型操纵子：效应物存在导致基因表达。阻遏型操纵子：效应物存在导致基因表达的关闭。,第三节 微生物代谢的调节,乳糖操纵子,乳糖操纵子的诱导机制
5、,乳糖存在时,乳糖缺乏时,色氨酸操纵子,（2）酶活性的调节（细调）,1）代谢合成途径中的关键酶是调节酶（别构酶、变构酶）2）别构酶调节模型（莫诺德模型）：催化活性中心和调节活性中心3）动力学模型：S型曲线4）脱敏作用5）调节中心6）调节酶的特点,（2）酶活性的调节（细调）,酶活性的激活（activation）前体激活：代谢途径中后面的酶促反应，可被该途径中较前面的一个中间产物所促进。代谢中间产物的反馈激活：代谢中间产物对该代谢途径的前面的酶起激活作用。,（2）酶活性的调节（细调）,酶活性的抑制（inhibition）：大多是反馈抑制,A.无分支代谢途径的调节：通常是在线形的代谢途径中末端产物对
6、催化第一步反应的酶活性有抑制作用。,A B C D X Ea Eb Ec Ed,抑制,B.有分支代谢途径的调节：在有两种或两种以上的末端产物的分支代谢途径中，调节方式较为复杂。分述如下：,（2）酶活性的调节（细调）,酶的顺序反馈抑制,A B C Ea,D E Y,F G Z,Eb,Ec,抑制,抑制,抑制,两个末端产物，不能直接抑制途径中的第一个酶Ea，而是分别抑制分支点后的Eb和Ec，造成中间产物C的积累，高浓度的C再反馈抑制Ea。,同工酶的反馈抑制,途径中的第一个反应（A B）被两个不同的酶所催化，一个酶被Y抑制，另一个酶被Z抑制。只有当Y和Z同时过量才能完全阻止A转变为B。另两个控制点（C
7、 D），（C F），分别受Y或Z的抑制。,同工酶是能催化同一生化反应，但它们的结构稍有不同，可分别被相应的末端产物抑制的一类酶。,A B C E2,D E Y,F G Z,E1,E3,E4,抑制,抑制,抑制,抑制,协同反馈抑制,末端产物Y和Z单独过量，对途径中第一个酶E1无抑制作用，只有Y和Z同时过量，才能对E1具有抑制作用。另两个控制点的酶E2和E3分别被Y和Z所抑制。,A B C E1,D E Y,F G Z,E3,E2,抑制,抑制,抑制,累积反馈抑制,末端产物Y和Z单独过量时，各自对途径中第一个酶E1仅产生较小的抑制作用，一种末端产物过量并不影响其他末端产物的形成。只有当Y和Z同时过量，
8、才能对E1产生较大的抑制作用。,A B C E1,D E Y,F G Z,40%,30%,58%,超相加反馈抑制,末端产物Y和Z单独过量时，各自对途径中第一个酶E1仅产生较小的抑制作用，一种末端产物过量并不影响其他末端产物的形成。当Y和Z同时过量，对E1产生的抑制作用则超过各种末端产物单独过量时的抑制的总和。,A B C E1,D E Y,F G Z,15%,20%,90%,反馈抑制与反馈阻遏的比较,4、细胞透性的调节,细胞质膜的透性直接影响物质的吸收和代谢产物的分泌，从而影响到细胞内代谢的变化。,工业生产的目的大量地积累人们所需要的微生物代谢产物。,在正常生理条件下,微生物通过其代谢调节系统
9、吸收利用营养物质用于合成细胞结构，进行生长和繁殖，它们通常不浪费原料和能量，也不积累中间代谢产物,代谢的人工控制,人为地打破微生物的代谢控制体系，就有可能使代谢朝着人们希望的方向进行,第二节 微生物代谢的人工控制,总体来说，人工控制微生物代谢的策略主要有两种：,一、生物合成途径的遗传控制,生物合成途径的遗传控制是通过诱变来实现的。这种突变不仅包括结构基因的突变，而且包括调节基因的突变。,1、切断支路代谢2、解除菌体自身反馈调节3、增加前体物的合成4、产物降解酶缺失突变株5、去处终产物（增加膜的透性）,进、通、截、堵、出,（1）对于直线式代谢途径：选育营养缺陷性突变株只能积累中间代谢产物 A a
10、 B b C c D d E,1）营养缺陷型的应用,末端产物E对生长乃是必需的，所以，应在培养基中限量供给E，使之足以维持菌株生长，但又不至于造成反馈调节（阻遏或抑制），这样才能有利于菌株积累中间产物C。,1、切断代谢支路,(2)分支代谢途径：情况较复杂，可利用营养缺陷性克服协同或累加反馈抑制积累末端产物，亦可利用双重缺陷发酵生产中间产物,A,B,C,D,E,F,各图成立的条件：1.限量添加E；2.限量添加E；3.限量添加E和G；4.限量添加E和G；5.限量添加I,“”表示营养缺陷突变位置；“”表示反馈调节解除,要根据其不同反馈控制机制,分支途径赖氨酸发酵:谷氨酸棒杆菌的Hom,分支途径肌苷酸
11、发酵（IMP合成途径的代谢调控）,调控理论的实践应用,2）渗漏缺陷型的应用 渗漏缺陷型是指遗传性障碍不完全的缺陷型。该突变是使酶的活性下降而不是完全丧失。,A,B,C,D,F,E,1）利用抗代谢类似物的突变积累代谢产物,菌体通常需要各种代谢物如维生素、氨基酸等合成菌体需要的成分，如果有与代谢物结构相似的物质存在，则可能产生两种结果：代谢物结构类似物和代谢物竞争同一个酶。通过诱变筛选出对抗代谢物相对应的代谢物不敏感，因此可以解除代谢物的反馈抑制作用。,2、解除菌体自身反馈调节,Asp Asp-P Asa,Met,Hse,Thr,Lys,AK1,AK2,AK3,HSDH,例：黄色短杆菌抗-氨基-羟
12、基戊酸（AHV）菌株能积累苏氨酸,AK1和HSDH的调节亚基的结构基因突变，不能与苏氨酸的结构类似物（AHV）结合，当然也不会同苏氨酸结合，所以能解除苏氨酸对AK1和HSDH的反馈抑制，因而积累苏氨酸。,Asp：天门冬氨酸；Asp-P：天门冬氨酰磷酸；Asa：天门冬氨酸半醛；Hse：高丝氨酸；Thr：苏氨酸；Met：甲硫氨酸；Lys：赖氨酸；AK：天门冬氨酸激酶；HSDH：高丝氨酸脱氢酶,2）营养缺陷型的回复突变株的应用 当难于找到合适的类似物或多重抗性交叉难以增加抗性标记，或反馈调节很复杂时，可采用营养缺陷型选育回复突变株的方法来选育高产菌。例：金霉素生产菌产绿链霉素诱变成 蛋氨酸缺陷型，再
13、回复突变成原养性，85%的回复突变株的金霉素产量提高 了倍。,营养缺陷型回复突变株,调节酶的变构特性是由其结构基因决定的，如果调节酶的基因发生突变而失活，则有两种可能性：,一是催化亚基和调节亚基的基因均发生突变；,另一种可能仅仅是催化亚基发生突变。,一是催化亚基和调节亚基恢复到第一次突变前的活性水平。,如果前者发生回复突变，则又有两种可能性,另一种是催化亚基得以恢复，而调节亚基丧失了调节的功能。,营养缺陷型回复突变,如想过量合成异亮氨酸需增加前体物苏氨酸的合成,3、增加前体物的合成,4、产物降解酶缺失突变株,有的代谢产物由于相应降解酶的存在而在发酵液中不能稳定存在，因此可通过诱变获得缺乏降解产
14、物的酶的菌株使发酵单位提高。,将诱变处理后的菌种接种到完全培养基上，生成的菌落再以影印法分别接种到含葡萄糖培养基和以产物作为唯一碳源的培养基上。在后一种培养基上不能生长的菌落就是缺乏产物降解酶的变异株。,5、细胞膜组分的缺失突变,以前经常提到反馈抑制和反馈阻遏，都是由于末端产物的浓度过高引起的。利用细胞膜组分的缺失突变使细胞膜的透性增大，可使代谢产物易于分泌到胞外，从而达到解除末端产物抑制或阻遏的目的。,例1：谷氨酸棒杆菌（生物素缺陷型）生产谷氨酸,PEP Pyr AcCoA,OAA akg GA,Mal,PC,PEP：磷酸烯醇式丙酮酸；Pyr：丙酮酸；AcCoA：乙酰辅酶A；OAA：草酰乙酸
15、；kg：-酮戊二酸；GA：谷氨酸；Mal：苹果酸；PC：丙酮酸羧化酶,生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，生物素在低于亚适浓度之前，增加生物素有利于丙酮酸的羧化产生草酰乙酸，进而有利于谷氨酸的合成；生物素是催化脂肪酸生物合成的初始酶乙酰辅酶A羧化酶的辅酶，该酶催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A，再经一系列转化合成脂肪酸，而脂肪酸又是构成细胞膜磷脂的主要成分，因此生物素可间接地影响细胞膜的透性。,生物素对谷氨酸合成的影响,例2：溶烷棒杆菌GL-21（甘油缺陷型）生产谷氨酸,磷酸二羟丙酮-磷酸甘油 磷酯,PGDH,该菌株的-磷酸甘油脱氢酶（PGDH）缺失，因此不能正常合成-磷酸甘油和磷酯。影响了细胞膜
16、结构的合成而使得细胞膜透性增大，有利于谷氨酸在菌体外积累。,6）选育组成型突变株和超产突变株,如果调节基因发生突变，以至产生无效的阻遏物而不能和操纵基因结合，或操纵基因突变，从而造成结构基因不受控制的转录，酶 的生成将不再需要诱导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏，这样的突变株称为 组成型突变株。少数情况下，组成型突变株可产生大量的、比亲本高的多的酶，这种突变株称为超产突变株。,组成型突变株,结构基因不受控制地转录，酶的生成将不再需要诱导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏。,调节基因发生突变,产生无效的阻遏物而不能与操纵基因结合,操纵基因突变,突变操纵基因不能与阻遏物结合,组成型突变,DAHP
17、,PEP+EP,Glu,莽草酸,分支酸,氨茴酸,色氨酸,苯丙酮酸,苯丙氨酸,预苯酸,对羟苯丙酮酸,酪氨酸,DS,CM,PDT,PAT,TS,生产实例,二、微生物发酵条件的控制,当菌株确定后，环境条件合适与否是发酵成败的重要因素，环境条件既影响微生物的生长，又影响代谢的速度和方向及产物的形成和积累。主要的有温度、pH、氧气含量、离子浓度等多种因素。,DA B C E F,发酵条件的调控,1.添加前体绕过反馈控制点：亦能使某种代谢产物大量产生,(-),(-),(-),2.添加诱导剂：从提高诱导酶合成量来说，最好的诱导剂往往不是该酶的底物，而是底物的衍生物，3.发酵与分离过程耦合：4.控制发酵的培养基成分：,控制细胞膜渗透性,使胞内的代谢产物迅速渗漏出去,解除末端产物的反馈抑制。用生理学手段 直接抑制膜的合成或使膜受缺损 如:在Glu发酵中把生物素浓度控制在亚适量可大量分泌Glu；控制生物素的含量可改变细胞膜的成分，进而改变膜透性；当培养液中生物素含量较高时采用适量添加青霉素的方法；再如：产氨短杆菌的核苷酸发酵中控制因素是Mn2+；Mn2+的作用与生物素相似。,本章要求,熟悉微生物的代谢调节方式熟悉微生物代谢的人工控制原理,
