中药制剂分析1.ppt

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1、中药制剂分析,第一章 绪 论 中药制剂分析是以中医药理论为指导，运用现代分析理论和方法研究中药制剂质量的一门应用学科。第一节 概 述 一、中药制剂分析的对象 中药制剂分析的对象应该是制剂组方中起主要作用的有效成分、毒性成分、或影响疗效的化学成分，对其做出定性、定量等各方面的评价。,二、中药制剂分析的特点 一）中药制剂分析的对象是复杂的混合物。1.组成中成药的中药材具有复杂性。中药材的同名异物，同物异名现象普遍存在。有的中药更由于形态相似，容易误用。2.中成药化学成分的多样性、复杂性。1 1）由多味中药组成的复方制剂，其化学成分极为复杂多样。2)各种化学成分在中药中的含量相差悬殊。3）中药制剂由

2、多种单味药材组成，所含化学成分相互影响。3.中成药的剂型繁多，所用之辅料多种多样，在测定前，样品必须经过预处理，以排除各种辅料的干扰，必要时还须进行辅料的检查和测定。4.工艺各异，很多在单味中药鲜品中存在的化学成分，经过炮制或制备工艺中经加热处理后已不复存在，或在制备过程中因挥发、分解、成盐(沉淀)反应等增加了中成药分析工程的困难。,二）首先进行组方分析，随方决定测定主药，选择合适的检测指标，是目前质量分析方法的特点之一。在进行质量分析时首先以中医理论和用药原则为指导，进行组方分析，按功能主治分出主、辅、从、次药味和药群，选择某合适的化学成分为指标来说明其与质量的关系。,三、影响中药制剂质量的

3、因素(一)原料药材的品种、规格、产地、药用部位、采收季节、加工方法的影响(二)炮制方法的影响（三）生产工艺的影响(四)中药制剂的包装、贮藏、保管的影响,四、中药制剂质量控制的现状和发展趋势 一）国外药物分析发展趋势 基本的方法主要为：分离分析法、电化学法、光谱法和联用分析方法等。各种色谱及其联用技术已成为占主导地位的常规分析方法，如HPTLC、HPLC、GC、HPCE、LC-MS联用等。体内药物分析研究，趋向于采用在线的联用微透析分析技术，如on-line MD-CE、on-line MDLC等。手性药物作为化学药物的特殊群体，以HPLC和CE为主要拆分手段的手性药物分析方兴未艾，已成为全世界

4、药物分析的研究热点。,二）国内中药制剂分析现状与发展趋势 1、国内中药制剂分析现状 1）光谱法的应用 A 比色法 如丹参素/丹参注射液，阿魏酸/当归浸膏-定量 B 紫外-可见分光光度法 单波长法 如蒽醌/何首乌，香豆素/祖师栗膏-定量；双波长法 靛蓝、靛玉红/喉痛消炎丸-定量；三波长法 小檗碱/三黄片-定量；一阶导数光谱法 绿原酸/感冒咳嗽冲剂，麻黄碱/哮喘丸-定量 二阶导数光谱法 胆酸/清宫冲剂，血竭/七厘散-定量；三阶导数光谱法 氢溴酸东莨菪碱/中麻2号注射液-定量。等,C 荧光法 丹参素/丹参注射液 D 红外分光光度法-体、-体/山道年；番木鳖碱、马钱子碱/马钱子 E 质谱法 F 核磁共

5、振光谱法 2）色谱法的应用 A 纸色谱法 已较少应用；B 薄层色谱法 应用广泛；C 棒状薄层色谱法 小檗碱/复方黄柏制剂、人参皂甙/人参、胆酸和去氧胆酸/熊胆-定量；D 气相色谱法 挥发性成分定量 冰片/复方丹参片/牛黄解毒丸/冠心苏合丸等；厚朴酚、和厚朴酚/藿香正气水，麻黄碱/葛根汤；,E 高效液相色谱法 应用广泛，以反相HPLC为主；黄连素/半夏泻心汤，红景天甙/红景天口服液，甘草酸/千金升白冲剂等。3）电化学分析法的应用 A 库仑法 B 电位法 药物电极测定法和电位溶出分析法 4）其他 A 原子吸收光谱法和冷原子技术 B 原子发射光谱 C X射线分析法 目前，中药体系存在的突出问题具体表

6、现在：(1)定量分析指标与其主要药效作用间缺乏相关性；(2)与化学药物相比，中药是一个由多成分、多因素构成的复杂体系，目前还没有建立起一套有效的中药复杂体系定量分析标准。,2。国内中药制剂分析发展趋势(1)中药有效成分的筛选与确定；应用仿生学、基因组学等学科的理论和进展，发现新的药物靶标，从分子、基因、受体、组织和整体水平系统准确地确定中药复杂体系中的药效物质；(2)中药有效成分的提取与分析；中药化学成分非常复杂，而且有效成分也具有相对性。为了高效率地提取中药有效成分，应用各种现代提取技术，如SFE、SWE、UAE等，可用于中药复杂体系中有效成分的提取，利用准确的仪器分析方法和计算机技术，通过

7、因子分析方法对中药复杂体系进行定性定量评价；(3)中药药效物质与中医药理论相关性研究；利用现代分析方法研究中药复杂体系中药效物质与中医药理论的定量关系，并结合现代医学理论，阐明其作用机制，在此基础上对中药及其复方进行全面质量控制。,第二节 中药制剂分析工作的基本程序 中药制剂分析程序一般可分取样、测试样品溶液的制备和测定（包括定性鉴别、杂质检查、含量测定）等。一、取样 1供试品要具有代表性：原则是均匀、合理。2严格按照规定的取样方法进行取样：一般应从每个包装的四角和中央五处取样，深度可达1/32/3处。取得的样品装入清洁、干燥、具磨口塞的容器或密封的塑料袋中，并注明品名、批号、数量、取样日期及

8、取样人。3抽取供试品的数量：各类中药制剂取样大致是至少够3次检验的用量。贵重药品可酌情取样。粉状制剂（散剂、颗粒剂）一般取样100g，可从包装的上、中、下三层及周围间隔相等部位取样若干，将所得样品混匀，按四分法从中取出所需供试量。,液体制剂（口服液、药酒、糖浆、酊剂等）一般取样200ml。同时须注意均匀取样。固体中成药（丸剂、片剂）成品取样一般为100g，压片后取样200片。丸剂一般取10丸。胶囊剂 称取不少于20个胶囊，倾出其中的药料，称定空胶囊的重量，由总重中减去，即为胶囊内药料的重量。依标示量及供试量称取部分药料供分析。一般取样量为100g。注射液的取样，灌注、熔封，灭菌前后应经过两次分

9、析。灌封前将注射液混合均匀，如 液体取样原则取样，再按标示量及供试量分别取部分进行检验；经灭菌后的注射液须按原来的方法进行分析检验。已封好的安瓿，取样量一般为200支。其它剂型的中成药，可根据具体情况随意抽取一定数量，作为随机抽样。供试样品检验完毕，应保留一半数量作为留样观察。,二、测试样品溶液的制备 中药制剂测试样品溶液的制备一般分为提取、分离、净化等过程。1.中药制剂样品的提取 冷浸法，61020倍药重溶剂，称重，浸泡122448小时，称重,，等分取样或取总样测定。适宜遇热不稳定的有效成分；连续回流法，样品置索氏提取器中，利用溶剂反复提取，提取效率高，溶剂少，遇热不稳定的有效成分不宜用此法

10、；超声波提取法，样品置容器中，溶剂提取，效率高，一般样品30min内即可完成。,2中药制剂样品的预处理 液-液萃取法:溶剂直接萃取、离子对萃取，操作繁，易乳化。沉淀法：采用某些试剂沉淀杂质或沉淀待测成分。蒸馏法：利用待测成分或其分解产物具有挥发性的特点，采用蒸馏法、收集馏液进行含量测定，必须明确测定成分的结构才可用此法。色谱法（液-固萃取法），常用净化剂有三氧化二铝、氧化镁、硅胶、活性炭、大孔树脂、离子交换树脂、硅藻土、键合相硅胶C18、C8等。其中离子交换树脂、硅藻土、键合相硅胶C18、C8等目前有较多商品预处理柱，使用方便，操作简单，净化效率高。,三、定性鉴别、检查和含量测定 1定性鉴别

11、1）性状鉴别系指中成药的形状、颜色、气味等，凡药典收载品，在药典中均有规定，可按要求进行检查。2）显微鉴别 因为含有中药原粉的中成药均保留中药材的显微特征。可以通过这些特征，对中成药进行定性鉴别。3）理化鉴别 药典中常用的方法有：荧光法、显色法、沉淀法、微量升华法；纸色谱法、薄层色谱、液相色谱、气相色谱等。中药定性鉴别应选择其中主药（君药）、辅药（臣药）作为主要对象，其次应鉴别毒剧药及贵重药材。,2检查 按我国药典要求，中药制剂需要检查的项目大致可分为三类：1）污染型 中成药一般杂质检查项目有：异物、灰分、酸不溶性灰分、重金属、砷盐等；卫生学检查：微生物细菌检查；以及有的产品要求农药残留量的检

12、测。2）特殊杂质型 原料药材掺假、有毒成分的限量检查。3）剂型的要求检查类型（制剂通则要求检查项目）中成药一般质量要求的检查有：挥发油测定、水分测定（固体制剂）、乙醇含量测定、总固体、相对密度、pH值（酊剂、药酒）、装量差异（片重差异）、崩解度（片剂、胶囊剂）、熔点测定、旋光度测定等。,3含量测定 中成药含量测定所采用的方法除经典的重量法、容量法(包括中和法、容量沉淀法、络合滴定法、氧化还原法及非水溶液滴定法等)外，还可采用电位法、库伦滴定法、比色法、可见-紫外分光光度法、红外分光光度法、液相色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、双波长薄层扫描法等。1）对有效成分明确的中药制剂要进行

13、有效成分的含量测定。2）大致明确有效成分，要求测定这些成分的总量。3）对有效成分已知但无理想的测定方法的中药制剂，可通过测定其中某些化学成分的含量间接控制有效成分的含量。4）对有效成分不明确的中药制剂可采用以下方法：选择可能的有效成分或主要成分（指示性成分）进行含量测定；测定药物的总固体量；选择在原料加工炮制时或制备、贮存过程中易损失、破坏的成分进行含量或限量测定。5）中药制剂中含有剧毒性成分则要测定其含量。6）贵重药材在制剂中投料量应加以测定。,第二章 中药制剂定量分析方法 第一节 可见-紫外光谱法 一、单一物质的定量 定量依据是Beer-Lambert定律，A=lC。测定单一物质时，先测定

14、物质的吸收光谱，然后选择最大吸收峰的波长max进行定量分析。一个物质若有几个吸收峰时，可选择吸收峰较高，在此吸收峰处吸光度随波长变化较小，并且其它物质无吸收的波长作为定量条件。一般不选择光谱最左边的末端吸收峰作定量测定的波长。常用定量方法：1.对照法 C样=C标A样/A标；C标A样/（A标C样）=样品%，C样和C标分别为样品浓度和标准品浓度，C样为样品标示浓度。2.标准曲线法：从标准品吸光度-浓度曲线求得样品浓度。,二、混合物的含量测定 一）混合物中有a，b两种组分，若两者的最大吸收峰不重合，且在a的1max处，b无吸收；在b的2max处，a无吸收。可分别在1max、2max处用单一物质的定量

15、方法从混合物中测定a、b的浓度。二）混合物中有a，b两种组分，吸收光谱部分重叠，在a的1处，b无吸收；在b的2处，a有吸收。先在2处测定总吸收Aa+b，再在1处测定Aa1；先从Aa1直接求出a的浓度，根据a的浓度求出Aa2。再从Aa+b减去Aa2后求得Ab2，就可求得b的浓度。,（三）双波长测定法 中药制剂分析中常用的方法为等吸收波长法和系数率法。1等吸收波长法 1）基本原理 根据左图选出两个波长1与2，其选择原则 是干扰组分a在1与2处吸收度相等，即 Aa1=Aa2。而待测组分b在1与2处的差吸 收度A应比较大，再在1与2处测混合组分 溶液的差吸度A。设1为参比波长，2为测量波长，则 等吸收

16、波长法原理示意图 A=Aa+b2-Aa+b1=（Aa2+Ab2）-（Aa1+Ab1）=Ab2-Ab1=（b2-b1）CbL,2）应用举例 喉痛消炎丸中靛蓝、靛玉红的测定）选择等吸收波长：用28g/ml的靛蓝及靛 玉红的氯仿溶液在分光光度计上扫描，并用同 法扫描出空白样品溶液的吸收曲线。从左图可知靛蓝在540nm、634.4nm处有合适 的等吸收波长；靛玉红却是在5142nm和 566nm处有等吸收波长，而空白样品液在上述 波长处的吸收曲线几乎成一条直线、不干扰测 图2-1-3 靛蓝、靛玉红的吸收曲线(1)靛蓝(2)靛玉红(3)无青黛样品 定，选取靛蓝的测定波长s1566 nm、参比波长R1=5

17、14.2 nm。可选靛玉红的测定波长s2=540nm、参比波长R2=634.4nm。,)标准曲线：精密吸取靛蓝对照品溶液0.25、0.50、2.0ml；靛玉红对照品溶液0.20、0.40、1.40ml，分别放入10ml量瓶中，用氯仿稀释至刻度，分别在上述等吸收波长处测其差吸收度：A1=A566nm-A514.2nm；A2=A540nm-A634.4nm；然后用A对C作标准曲线；并求出其一元回归方程：A10.02241C1(r11.0000)A20.04060C2+0.0055(r21.0000)含量测定：精称喉痛消炎丸细粉约0.2g于索氏提取器中，用氯仿提取至无蓝色，用氯仿定容于50ml量瓶中

18、，再精密吸取5ml置10ml量瓶中，加氯仿至刻度即为样品溶液。将样品溶液在s1与R1，处测出A样1值，用以上A1式求出靛蓝的浓度及样品中靛蓝的含量。同样，在s2与R2处测出A样2，用以上A2式求出靛玉红的浓度及样品中靛玉红的含量。2 联立方程法 A a+b1=Aa 1+Ab 1=a 1 CaL+b 1 CbL A a+b2=Aa 2+Ab 2=a 2 CaL+b 2 CbL,（四）三波长测定法 此法要求在任一吸收曲线上，能找出满足下述条件的三个波长：即在干扰组分的吸收曲线上，与三个波长相应的点，能在一条直线上。1基本原理 左图中1、2、3为在任一吸收曲线上，任意 选择的三个波长。A1、A2、A

19、3为在三个波长处 分别测出的吸收度。根据相似三角形的等比性质，可推导出下式，A=A2-（m A1+nA3）/（m+n）=2（m1+n3）/（m+n）CL 三波长分光光度法的原理 说明A与待测组分浓度C成正比。,2应用举例 二陈丸中陈皮甙的测定 1）总干扰组分的制备及其吸收光谱)除去陈皮甙后，陈皮其他组分提取液的制备：用溶剂(含0.1氢氧化钠的75乙醇液)提取陈皮粉，提取液经薄层分离，刮取除陈皮甙以外的所有斑点洗脱，得除陈皮甙以外陈皮其他组分提取液(I)。)二陈丸空白粉提取液的制备：按处方比例 配制除陈皮以外的二陈丸空白粉，用上述溶 剂提取，得二陈丸空白粉提取液()。将(I)、()按处方比例混合

20、，得二陈丸总干 扰成分液()。分光光度计分别测定陈皮甙对 照品和()的吸收光谱。见左图。其他成分对 陈皮甙的测定有干扰，用6批不同来源的原料按上法制备()，并测其吸收光谱，结果谱形相似。可采用三波长法消除干扰。,2）选择三个测定波长 作图法粗选，再计算精选在()的A=0处，即为精选的三个波长：1=318.0nm，2=286.0nm，3=275.0nm。3）标准曲线 配制不同浓度的陈皮甙对照品溶液，在选出的三个波长处，分别测定吸收度，并算出A值，对A值与浓度C进行直线回归，回归方程为：A=9.9059C 0.0024(r=0.9990)4）样品测定 精密称取二陈丸细粉约0.1g，加100.0ml

21、上述溶剂浸泡提取15小时，过滤，取续滤液2.0ml，用溶剂稀释至5.0ml，在选出的三波长处，分别测定吸收度，计算其A值，再按回归方程算出陈皮甙含量。本法平均回收率：98.28，RSD：2.12。,（五）差示光谱法 1基本原理 差示光谱法的关键有二，其一，提供一个近似理想的参比溶液。其二，使待测组分发生特征光谱变化，而赋形剂或其他共有组分却不引起光谱变化，因而可消除它们的干扰。设Ax、Ay分别代表两种不同介质中待测组分在测定波长处的吸收度，Az代表背景和干扰组分的吸收度，其不受测定介质改变的影响。根据吸收度加和性原理，则 A=A样-A参=(Ax+Az)-(Ay+Az)=Ax-Ay=(x-y)C

22、L 差示光谱中的振幅，即最大吸收与最小吸收之差值，也可进行定量测定，这可提高本法的专属性。,2应用举例 差示光谱法测定含牛黄的中成药中胆红素的含量 1）测定原理 胆红素具有高度共轭体系结构，在波长453nm处为最大吸收，在可见光照射下胆红素易氧化成蓝色产物，在453nm处吸收度显著降低。2）选用日光下照射30分钟或在红外灯下照射4小时测A值。3）精密称取胆红素2mg于50ml棕色量瓶中，加入适量冷(10以下)的酸性氯仿(150ml氯 仿中含0.05ml浓盐酸)，于冰水浴中超声振 荡20分钟，稀释至刻度，制成储备液。准确 吸取0，4、08、1，2、1.6、2.0ml储备液 于10ml量瓶中，加冷

23、酸性氯仿至刻度，测其 光照前后在453nm处的吸收度。回归方程 胆红素在酸性氯仿溶液中的吸收光谱 为A=0.0804C+0.00570(r=0.9995)。a光照前 b光照后 除光照反应外，其余操作均需避光。,4）分别制得六应丸、六神丸、牛黄消炎丸的空白样品对照液，在453nm处测得各自光照前后的A值，计算A。实验表明三种成药A值为零或几乎为零。说明其他干扰组分在以上光照条件下不干扰胆红素的测定。5）精密称取六应丸、六神丸各60mg，牛黄消炎丸120mg置10ml带塞的试管中，准确加入冷酸性氯仿10ml，冰水浴中振荡20分钟，过滤，弃去初滤液，测续滤液光照前后的A值，算出A值。由回归方程算得样

24、品的含量。本法加样回收率：六应丸为98.8，RSD=1.8；六神丸为100.7，RSD=2.2；牛黄消炎丸为93.0，RSD1.1。,（六）导数光谱法 1导数光谱及其特征 通常的吸收光谱，其吸收度是波长的函数 A=CE=C（）。对波长求导，将其微分系 数（dnA/dn）对波长扫描可得导数光 谱图。特征：(1)导数光谱的阶数愈高，峰形愈尖锐且数 量亦增多。(2)在零阶光谱的极大处，其相应的奇阶光 谱通过零点。在零阶光谱的两拐点处，奇阶 导数光谱为极大或极小。(3)偶阶导数光谱的形状与零阶光谱类似，零阶光谱的峰值对应于偶阶导数光谱的极值，零阶光谱的拐点在偶阶导数光谱中通过零点。(4)导数光谱谱带的

25、极值数等于导数阶数加1。高斯曲线及其一至四阶导数曲线,导数分光光度的优点：a能检出两个或两个以上的重叠吸收带；b能分辨在强吸收曲线“肩部”的弱吸收带；c能精密确定单一吸收峰位置；d能消除基线（背景）的影响；e能进行定量测定。2基本原理 吸收光谱服从Beer定律：ACL 根据导数光谱的定义，对上式求导，则：dA/d=（d/d）CL；d2A/d2=（d2/d2）CL；dnA/dn=（dn/dn）CL；式中L为定值，给定物质在特定波长处的d/d、d2/d2dn/dn也是定值，因此，dA/dC，d2A/d2CdnA/dnC。,常用的定量参数的选择方法有：1）峰-谷法 测量相邻峰、谷之间的距离。左图中的

26、h1h2(振幅，用D表示)。2）基线法 取相邻二同向峰(正或倒)的 公切线为基线，以中间的反向峰峰尖至基线 的距离为测量值。左图中p1。3）峰-零法 测量峰值到零线间的垂直距 离，左图中p2。4）面积法 根据一阶或二阶导数光谱面 导数光谱的测量 积，进行定量测定。3共存组分干扰吸收的消除 1）一阶导数光谱法消除线性干扰吸收 A=CL+a+b dA/d=（d/d）CL+a 说明线性干扰在一阶导数光谱中对定量参数D(振幅)没有影响，D只与待测组分浓度成正比。D=(dA/d)峰-(dA/d)谷=(d/d)峰-(d/d)谷CL,2）高阶导数光谱法消除非线性干扰吸收及用于重叠峰的分离，定量 若干扰组分吸

27、收对波长呈非线性，为一近似的二次吸收曲线，则总吸收度为 A=CL+e2+f+g 对其求一阶、二阶导数得：dA/d=（d/d）CL+e+f d2A/d2=（d2/d2）CL+e 4.导数光谱法中的主要参数 1)微分阶数(n)n的选择主要由干扰组分吸收曲线的形状而定。n越大，分辨力愈强，但信噪比将降低。2)波长间隔()愈大，测量灵敏度增大，但分辨率降低，通常选12nm为好。3)中间波长(m)通常需选两个m，即m1、m2。其选择原则：待测组分的导数曲线在m1、m2处的形状易辨认，较特征；而干扰组分在此处的导数值相等或相近。,5.应用举例 1)肺露中丹皮酚含量的测定()干扰丹皮酚测定情况的考察：按处方

28、配比，分别取药材，加水适量，蒸馏提制成22味药材的模拟液，以水为空白，分别绘制紫外吸收光谱图。从图中看出，牡丹皮蒸提液紫外吸收很强，枇杷叶和芦根蒸提液紫外吸收较弱，干扰丹皮酚的测定，实验表明：丹皮酚在碱性溶液中的吸收光谱发生红移，=352nm。1牡丹皮 2枇杷叶 3芦根,()选择测定波长 精取丹皮酚对照液2ml，枇杷叶和芦根蒸提液各10ml，分别于25ml量瓶中，加0.1mol/L氢氧化钠溶液至刻度，混匀。以0.1mol/L氢氧化钠溶液为空白，绘制吸收光谱（零阶）和一阶导数光谱，如下图。按中间波长选择原则，选330和370nm为中间波长，则测定波长为328nm和332nm，368nm和372n

29、m。蒸提液在0.1molL氢氧化钠溶液中的光谱图 一阶导数光谱图1肺露 2丹皮酚 3枇杷叶 4芦根 1丹皮酚 2枇杷叶 3芦根,()标准曲线 精密量取丹皮酚对照液(0.1mg/ml)0.5、1.0、3.0ml，分别于25ml量瓶中，加0.1mol/L氢氧化钠溶液至刻度，混匀，以0.1mol/L氢氧化钠溶液为空白，在测定波长处测吸收度，计算一系列A值。A=(A328-A332)-(A368-A372)。标准曲线的回归方程为：A=-11.08C+0.0009（r=0.9997）()样品测定 取同一批号或不同批号样品，分别精密量取10ml于25ml量瓶中，加0.1mol/L氢氧化钠溶液至刻度，混匀，

30、以0.1mol/L氢氧化钠溶液为空白，在测定波长处测其吸收度，算出A，根据标准曲线的回归方程，计算样品中丹皮酚含量。本法平均回收率99.57，RSD=0.82%。,2）清宫冲剂中胆酸的二阶导数光谱测定法（）干扰情况的考察 胆酸对照液与样品的二阶导数光谱显示，在397nm，386nm波长处有相应的吸收峰和吸收谷。阴性样品二阶导数光谱呈近乎平直线条，见下左图。猪去氧胆酸的二阶导数光谱将360420nm区间的吸收消除为二次无关吸收，不干扰样品中胆酸的含量测定如下中图。下右图表明，胆酸二阶导数光谱，其峰-谷振幅值D与浓度具有良好的线性关系，因此，可用397nm，386nm两波长的振幅D为定量参数，用峰

31、-谷法进行测定。样品，胆酸对照品溶 胆酸、猪去氧胆酸二 对照品溶液 液二阶导数光谱 阶导数光谱 二阶导数光谱A样品 B.胆酸对照品 C.阴性样品 1胆酸 2猪去氧胆酸,()测定条件 零阶光谱扫描波长：190550nm；二阶导数光谱扫描波长，360420nm；=5nm。()标准曲线 精密称定胆酸对照品约30mg，置100ml量瓶中，加入60醋酸稀释至刻度，分别精密吸取0.1、0.21.0ml于15ml具塞刻度试管中，加60醋酸至1.0ml，加入稀硫酸140ml，摇匀，70水浴中放置20分钟，取出静置20分钟后，用1.0ml 60醋酸加14.0ml上述稀硫酸作空白，测二阶导数光谱。中间波长397n

32、m，386nm，测出各峰-谷振幅值D，得回归方程：D=57.3066C 0.1547(r=1000)()样品测定 精密称取约2.5g样品粉末加50ml氯仿回流提取4小时，常压回收氯仿至干，用60醋酸溶解，定容于10ml量瓶中，精密吸取1.0ml样品液于15ml具塞刻度试管中，按标准曲线项下操作，测峰-谷振幅值D，按回归方程计算样品中胆酸含量。本法平均回收率：102.9，RSD0.6。,第二节 薄层色谱法 薄层色谱法(TLC)是一种微量的分离分析技术，具有设备简单，检出灵敏，测定快速，应用广泛等特点。薄层色谱定量的方法可分为二类，一类是薄层洗脱定量法，将被测化合物从薄层上洗脱下来，萃取后，再选择

33、适当方法进行测定。另一类是在展开后的薄层上直接进行测定。一、薄层洗脱定量 1点样 在薄层板的起始线上，将定量的样品液点成一条状，点样时应避免任何损失。在板的两边，点上对照品作为定位剂，如图A，然后，在选好的溶剂中层开，斑点要集中，不应有拖尾现象。2定位 对本身有颜色的化合物可直接定位，对有荧光的化合物可在紫外光下观察定位，对多数无色化合物不可在薄层上直接喷显色剂定位，此时，应将待测组分的薄层部分用玻璃板悬空盖住后再喷，这样可利用两边的对照点显色定位。,3捕集、洗脱和测定 定位后，应捕集洗脱，若为软板，可将待测组分的带状区域用捕集器收集，如图(B)。若为硬板，可直接用捕集器收集，也可用刀片将样品

34、区带的吸附剂定量地刮下，再用合适溶剂洗脱后，进行定量测定，如图(C)。,洗脱溶剂，一般应选极性较大，对待测化合物溶解度亦较大的溶剂，如乙醚、氯仿、丙酮、乙醇、甲醇等，在单一溶剂洗脱效果欠佳时，可采用混合溶剂。洗脱方法可采用渗滤法、多次浸出法、加热温浸法、索氏回流提取法等。对不易洗脱的化合物，也可不经洗脱，在吸附剂中加入适当的显色剂，使其定量反应，然后离心或过滤后再进行测定。,二、薄层上直接定量 薄层上直接定量的方法有目测法、测面积法、仪器测量法。，目前，用薄层扫描仪扫描测定斑点中化合物含量的方法已成为薄层定量的主要方法，此法也可用于纸色谱、电泳凝胶及其他介质的色谱。(一)测定原理与方法 1吸收

35、测定法(1)Kubelka-Munk原理及方程：当强度为I0的单色光照射到厚度为X的薄层后，其情况如下图所示。I0为入射光强度 i（x）为x处的透射光强。j（x）为x处的反射光强。X为固定相厚度。,Kubelka-Munk指出，当强度为I0的单色光照射到厚度为X的薄层后，光的反射和透射符合下述微分方程：-di/dX=-(S+K)i+Sj dj/dX=-(S+K)j+Si S：单位厚度薄层固定相的散射系数；K为薄层色谱斑点或单位厚度薄层固定相的吸收系数；X为由载板表面算起的薄层厚度。i与j的一般解为：i=Asinh(bSx)+Bcosh(bSx)j=(aA-bB)sinh(bSx)+(aB-bA

36、)cosh(bSx)A，B常数，a=（S+K）/S，b=（a2-1）1/2，Sinh=（ex-e-x）/2；Cos=（ex+e-x）/2，A/B=a/b。为讨论方便，一般计算边界的i和j，即薄层下表面的透射光和上表面的反射光。X=0时，j=0，i=I0T X=X时，i=I0，j=I0R 则 T=b/asinh（bSX）+bcosh（bSX）R=sinh（bSX）/asinh（bSX）+bcosh（bSX）SX称作散射参数，它与薄层厚度、散射系数有关。Merck硅胶板的SX=3，青岛硅胶板SX3，日本和光硅胶F板SX=7。,SX数值大小直接影响薄层色谱斑点的吸光度-浓度曲线偏离Beer定律的程度

37、。薄层色谱斑点中物质的含量包含于a及b两个参数中，已知a=（S+K）/S，b=（a2-1）1/2，乘以X，则 a=（SX+KX）/SX b=KX（2SX+KX）1/2/SX KX为吸收参数，相当于薄层色谱单位面积中物质的含量（g/cm2），即KX=C。,薄层色谱斑点的吸光度：理想的空白薄层板的K=0，但一般K0。为消除影响，通常以空白板为基准，测定相对透光率及相对反射率来计算薄层色谱斑点的吸光度。透射法 A=-lg（T/T0）反射法 A=-lg（R/R0）-lgT/T0或-lgR/R0为仪器检测部分所获得的信号，它们和KX间的关系曲线相当于一般分光光度法中的A-C曲线，在溶液中，A-C曲线为一

38、直线，而在薄层上，-lgT/T0或-lgR/R0和浓度间不呈线性关系，比较下图可以看出弯曲度随SX增加而增加。不同SX时，吸光度与KX间关系曲线 a透射法测定-lgT/T0与KX间关系 b反射法测定-lgR/R0与KX间关系,目前对Kubelka-Munk曲线处理采用两类方法：曲线校直法和计算机回归法。岛津CS系列采用前者，CAMAG仪器采用后者。1校正前的标准曲线 2校正后的标准曲线 曲线校直法是一种简便的薄层色谱扫描定量校准方法，但比较粗糙，且有时难于知道薄层板的SX的准确值。,2荧光测定法 荧光测定法的定量依据为：F=I0abC F为荧光强度；为荧光效率；I0为入射光强度；a为吸收系数；

39、b为薄层厚度；c为样品浓度。F与C成正比，二者之间存在线性关系。荧光测定法与吸收测定法不同，其测量值与斑点形状无关。本身具有荧光或经过适当处理后可产生荧光的化合物均可用本法测量。荧光测定法选择性高，因激发光与荧光波长均能加以选择，可避免一些其他组分的干扰，其灵敏度比吸收法高1001000倍，最低可测到1050pg样品。3荧光淬灭法 用紫外光照射荧光薄层板时，薄层板产生荧光(背景)，而在板上样品斑点处，因样品对紫外光有吸收，照到薄层斑点处的紫外光有所减弱，则产生的荧光也减弱，样品呈暗色斑点。测定时，由荧光减弱的程度测出样品中被测物含量。,(三)定量方法 主要有外标法和内标法，前者更为常用。1外标

40、法 首先做待测组分的标准曲线，其纵坐标为各个斑点的峰面积积分值A，横坐标为相应各斑点的物质量(微克数)。此时做标准曲线有2个目的，其一确定该组分的线性范围。其二看标准曲线是否通过原点，若通过原点，分析样品时用外标一点法定量，若不通过原点，分析样品时用外标二点法定量。(1)外标一点法：CFA(2)外标二点法：C=F1A+F2 C1=F1A1+F2 C2=F1A2+F2 解联立方程得：F1=（C1-C2）/（A1-A2）F20.5(C1+C2)0.5 F1(A1+A2),2内标法 通常配2份不同浓度的含不同量内标物的对照品溶液，并在一定量样品溶液中加入已知质量的内标物，将这两种溶液分别点在薄层上，

41、展开后，内标物与对照品分开，用同一波长扫描，测峰面积。用对照品与内标物的峰面积比为纵坐标，用二者的浓度比为横坐标作图，所得曲线即为标准曲线。内标一点法 C/CIS A/AISF FC/CISAIS/A 内标二点法中标准曲线的方程式为：C1/（CIS）1=F1A1/（AIS）1+F2 C2/（CIS）2=F2A2/（AIS）2+F1解上述联立方程式得：F1=C1/（CIS）1-C2/（CIS）2/A1/（AIS）1-A2/（AIS）2 F2=0.5C1/（CIS）1+C2/（CIS）2 0.5 F1A1/（AIS）1+A2/（AIS）2,(四)影响薄层扫描定量的因素 1吸附剂性能及薄层质量 薄层

42、厚薄要均匀，吸附剂粒度要均匀。粒度不均，影响散射系数。厚度增加，Rf值增大。厚度下降，展开后斑点扩散较严重。透射法测定时，厚度增加，峰面积值增加；反射法测定时，厚度增加，峰面积值减少。2点样操作与随行标准 原点直径以13mm较合适，点样过多会使原点“超载”，展开剂出现“绕行”现象，引起斑点拖尾或重叠，使扫描峰形不对称或不能“基线分离”。定量点样时，尽可能在同一块薄层板上同时点上已知浓度的对照品，即随行标准，一同展开，定量，并由这些对照品的测定值计算样品含量。3展开条件 将薄层板与展开槽进行预饱和，可得到重现的色谱图。展开时温度变化应尽量小。展距要适宜，一般Rf值在0.20.8时最佳。展开用的溶剂必要时需经过预处理。,4.展开后要彻底清除溶剂，方可扫描。5.显色 显色后应注意斑点的稳定性，测量时必须在稳定的时间中进行。为提高色斑的稳定性，可将显色后的薄层板避光保存，以同样大小的玻璃片覆盖并密封或将薄层板浸入20聚乙二醇甲醇溶液中，待甲醇挥发后，薄层上形成聚乙二醇薄膜，使色斑与空气隔绝，以保证色斑的稳定。,