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1、基因工程,专题1,什么叫基因工程？,基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。该技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。,（一）基因工程的概念,（一）、基因工程的概念,1、原理：,2、操作水平：,3、又称：,4、优点：,基因重组,DNA分子水平,DNA重组技术或基因拼接技术,定向改造生物性状,克服远缘杂交不亲和的障碍,育种周期短,（二）DNA重组技术的基本工具,准确切割DNA的工具（“分子手术刀”）DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）基因转移工具（“分
2、子运输车”）,基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、拼接等操作，没有非常精细的工具是不行的。进行基因操作最少需要以下三种工具：,识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶。能将外来的DNA切断，由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶。,4000种。,形成两种末端,“分子手术刀”限制性核酸内切酶,限制酶切割DNA后形成的末端黏性末端、平末端是如何形成的？,重播,什么叫黏性末端？,当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸
3、，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,什么叫平末端？,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？,（二）基因操作的工具,要切两个切口，产生四个黏性末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,“分子缝合针”DNA连接酶,（二）基因操作的工具,DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，是把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子才能形
4、成。,寻根问底：,DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？,限制酶切割后有两种不同的结果，一种产生黏性末端，一种产生平末端。那么恢复它们的连接时，所用DNA连接酶是否可以不加选择？,E.coliDNA连接酶：连接黏性末端,T4DNA连接酶：连接黏性末端和平末端,基因进入受体细胞的载体,假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？作为载体没有切割位点将怎样？目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？如果载体对受体细胞有害将怎样？,运载体,1.作用：2.种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。,要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细
5、胞的工具就是运载体。,将外源基因送入受体细胞。,3.作为运载体必须具备哪些条件？,（二）基因操作的工具,1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3）具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。,4.大肠杆菌的质粒：,（二）基因操作的工具,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素的标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。,1.以下说法正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限
6、制酶切点，以便与外源基因连接 D、DNA连接酶使黏性末段的碱基之间形成氢键,C,练习,2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制（）B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,练习,3.有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性状，培育生物新品种 B、重组DNA的形成在细胞内完成 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、质粒都可作为运载体,B D,练习,（三）、基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,操作过程,目的基因的检测与鉴定,目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,目的基因的获取,即
7、：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来,目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。,1）从基因文库中获取目的基因,1.什么是基因文库？2.怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？,获得目的基因的方法,2）利用PCR技术扩增目的基因3）人工合成,含有一种生物的全部基因,含有一种生物的部分基因,根据基因的有关信息：如基因的转录产物mRNA,基因文库的构建方法,：直接分离法,供体细胞中的DNA,许多DNA片段,运载体,限制酶,受体细胞,产生特定性状,导入,外源DNA扩增,目的基因,分离,(鸟枪法),目的基因的获取,1）从基因文库中直接获取,多
8、用于原核生物,目的基因的mRNA,单链DNA(cDNA）,双链DNA(即目的基因),反转录,合成,人工合成法a.反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,b.根据已知的氨基酸序列合成DNA法：,PCR技术聚合酶链式反应,原理：前提：条件：,PCR扩增仪,DNA双链复制的基本原理,一段已知目的基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,热稳定DNA聚合酶(Taq酶）,DNA的两条链为模板,温度控制,细胞核,只有DNA的
9、一条链,四种核糖核苷酸,RNA聚合酶,ATP,A-U C-G T-A G-C,细胞核,DNA的两条链,四种脱氧核苷酸,解旋酶、DNA聚合酶,ATP,A-T C-G T-A G-C,两个双链DNA分子,一条单链mRNA,边解旋边复制，半保留复制,边解旋边转录,变性,1.目的基因DNA受热变性，解链；2.引物与单链互补结合；3.合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。,利用PCR技术扩增目的基因,PCR技术扩增过程,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，断裂，形成_,b、复性（55-60）：系统温度降低，引物 与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用
10、下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,1.用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。2.用_切断目 的基因，使其产生_ _。,核心,3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,(二)基因表达载体的构建,科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)
11、，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。,资 料:,基因表达载体的组成：,目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,(三)将目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。,将目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,转化,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,方法,导入植物细胞,导入动物细胞,导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因
12、枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞吸收DNA分子,(三)将目的基因导入受体细胞,目的基因插入Ti质粒的T-DNA上 农杆菌 导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体上 目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达,1.农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上,2.转化,显微注射法：将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中,三、将目的基因导入受体细胞,2、导入动物细胞,2.微生物作受体细胞原因：,将目的基因导入微生物细胞,3.转化方法：,大肠杆菌,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,处理细胞细胞表达载体与感受态细胞混合 _细胞吸收DNA分子。,Ca2+
13、,感受态,感受态,1.常用菌：,(四)目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交,抗原-抗体杂交,1.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是,2、下列属于获取目的基因的方法的是()利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成A.B.C.D.,3.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高
14、受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测C增加质粒分子的分子量D便于与外源基因连接4.有关基因工程的叙述正确的是A限制酶只在获得目的基因时才用B重组质粒的形成是在细胞内完成的C质粒都可作为运载体 D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,5.哪项不是基因表达载体的组成部分()A.启动子 B.终止密码 C.标记基因 D.目的基因6.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法()A基因枪法 B显微注射法 C.农杆菌转化法 D花粉管通道法,1.3 基因工程的应用,基因工程,医学,牧业,总结,农业,抗虫转基因植物,利用转基因改良植物品质,抗逆转基因植物,抗病转基因植物,1、转基因作
15、物,虫害,t毒蛋白基因；淀粉酶抑制基因；植物凝集素基因。,抗虫转基因植物,抗虫植物,抗病转基因植物,抗病基因,病毒外壳蛋白基因；病毒复制酶基因；几丁质酶基因；抗毒素合成基因。,花叶病,抗逆转基因植物,抗盐碱、干旱基因。,干旱,调节细胞渗透压,盐碱地,涝灾,抗盐碱、抗旱、耐寒、抗除草剂。,利用转基因改良植物品质,食品营养不均衡,赖氨酸含量提高30%。,返回,2、转基因动物,提高动物生长速度,用于改善畜产品品质,牛奶：乳糖不能完全消化、或有过敏症状。,返回,3、医药卫生,基因治疗,器官移植,基因工程药品,生物反应器,返回,生物反应器,药物蛋白基因,乳腺蛋白基因,显微注射,受精卵,转基因动物,乳汁中
16、含所需药品,器官移植,人体移植器官短缺,替代移植器官,免疫排斥,基因工程,改造动物器官,器官供体基因组,调节因子,抑制或除去原基因表达,克隆,无免疫排斥的移植器官,基因工程药品,重组人胰岛素,转基因工程菌,生产药物,细胞因子、抗体、疫苗、激素。,预防和治疗：肿瘤、心血管疾病、遗传病、传染病、糖尿病、类风湿等。,基因治疗,遗传性疾病病人,正常基因,基因表达、发挥功能。,体外基因治疗：从病人体内获取某种细胞进行培养，然后，在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩大培养，最后重新输入患者体内。,体内基因治疗：用基因工程的方法，直接向人体组织细胞中转移基因的治疗方法。,例1、继哺乳动物乳腺发生器研发
17、成功后，膀胱生物发生器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培养出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答：（1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是_。（2）进行基因转移是，通常要将外源基因转_中，原因是。（3）通常采用 技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组（4）在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的 细胞中特异表达。（5）为使外源基因在后代长期保持，可将转基因小鼠细胞的 转入 细胞中构成重组细胞，使其发育成与供体具有相同性状的个体。该技术称为。,显微注射,受精卵,受精卵具有全能性，可使外源基因在相应组织细胞表达,DNA分子杂交,膀胱上皮,细胞
18、核,去核的卵,核移植（或克隆）,例2、器官移植是治疗人类某些疾病的有效治疗方法，如对大面积烧伤病人采取的皮肤移植，肾衰竭病人的肾移植，冠心病人的心脏移植等。下面就器官移植的话题，回答相关问题：英国科学家已经研究用动物的器官作为器官移植的器官来源，科学家发现猪的内脏器官与人的内脏器官大小、形态均差不多，他们从20世纪80年代就开始研究。研究的重点是改造猪细胞膜。（1）猪细胞膜的基本结构和人的细胞膜是相同的，但其上的和人细胞膜有很多是不同的。（2）改造猪细胞膜主要是通过 技术进行，具体操作步骤：,糖蛋白,基因工程,第一步，获得控制目的基因（人体细胞膜上蛋白质合成的基因），所用的方法有。第二步，将目
19、的基因与 结合；第三步，将目的基因导入受体细胞，对猪来说，应导入其细胞最有效。在这项技术中，必须使用的两种工具酶是和。,鸟枪法、反转录法、化学合成法,运载体,受精卵,限制酶,DNA连接酶,例3、1997年，科学家将动物体内的能够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA分子重组，并且在大肠杆菌中表达成功。如右图，请据图回答问题。(1)此图表示的是采取_方法获取_基因的过程。,人工合成基因,胰岛素（目的）,(2)图中DNA是以_为模板，_形成单链DNA，在酶的作用下合成双链DNA，从而获得了所需要的_。(3)图中代表的是_酶，在它的作用下将质粒切出_末端。(4)图中代表重组DNA，含_基因。(5)图中表
20、示的过程是_。,胰岛素mRNA,逆转录,胰岛素（目的）基因,限制性核酸内切酶,黏性,胰岛素基因,重组DNA导入受体细胞,例4、基因治疗是指（）A、把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗目的B、对有缺陷的细胞进行修复，从而使其恢复正常，达到治疗的目的C、运用人工诱变的方法，使有基因缺陷的细胞发生基因突变，从而恢复正常D、运用基因工程技术，把有缺陷的基因切除，达到治疗疾病的目的,A,例5、患者缺乏正常的人体免疫功能，只要稍被细菌或病毒感染，就会性病死亡。经过研究证实，SCID病人细胞的一个常染色体上编码腺苷酸脱氨酶的基因发生了突变。（1）请你利用所学知识，设想一个治疗SCID病的方案。第
21、一步：发现人体正常ada基因克隆后用来替换反转录病毒的原有基因，构建重组载体；第二步：从SCID病人体内分离出免疫系统有缺陷的T淋巴细胞第三步：；第四步：；（2）还有哪些遗传病可用基因治疗的方案进行治疗？试举例。,将这些T淋巴细胞与携带了正常ada基因的反转录酶病毒混合在一起，让病毒感染T淋巴细胞，使正常的ada基因扩增并插入到T细胞的基因中；,在实验室中通过细胞培养并确认转入的基因成功表达后，用注射器将成千上万个重组的转基因T细胞注射到SCID患者的个体组织中。,血友病，镰刀型细胞贫血症。,例6、应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是指（）A
22、、用于检测疾病的医疗器械B、用放射性同位素或萤光分子等标记的DNA分子C、合成球蛋白的DNAD、合成苯丙羟化酶的DNA片段,B,蛋白质工程的崛起,1、基因工程的应用（1）基因工程的实质：将一种生物的 转移到另一种生物体内，使后者产生本不能产生的，进而表现出新的。（2）基因工程的不足：在原则上只能生产自然界已存在的。2、天然蛋白质的不足 天然蛋白质是生物在长期 过程中形成的，它们的 符合特定物种 的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。3、蛋白质工程的目的 生产符合人类生产和生活的需要的。,一、蛋白质工程崛起的缘由,基因,蛋白质,性状,蛋白质,进化,结构和功能,生存,蛋白质,二、蛋白质工程
23、的基本原理,1、目标：根据人们对 功能的特定需求，对蛋白质的 进行分子设计。2、原理：改造基因（基因 或基因）。3、流程：预期蛋白质功能设计 推测应有的 序列找到对应的 序列。,蛋白质,结构,修饰,合成,预期的蛋白质,氨基酸,脱氧核苷酸,蛋白质三维结构,氨基酸序列多肽链,基因DNA,mRNA,中心法则？,蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程有什么不同？,？,答：基因工程是遵循中心法则，从DNAmRNA蛋白质折叠产生功能，基本上是生产出自然界已有的蛋白质。蛋白质工程是按照以下思路进行的：确定蛋白质的功能蛋白质应有的高级结构蛋白质应具备的折叠状态应有的氨基酸序列应有的碱基排列，可以创造自然界不存
24、在的蛋白质。,蛋白质工程的概念,蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。,蛋白质工程的实质是对编码蛋白质的基因进行改造,目的基因,预期的蛋白质功能,基因表达载体,基因,获取目的基因构建表达载体导入受体细胞目的基因的检测与表达,预期蛋白质功能设计蛋白质结构推测氨基酸序列推测核苷酸序列合成DNA 表达出蛋白质,定向改造生物的遗传特性，获得人类所需的生物类型或生物产品,定向改造或生产人类所需的蛋白质,生产自然界中已有的蛋白质,蛋白质工程是在基因工程的基础上,延伸出来的第二代基因工
25、程。因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因的修饰或基因的合成。,生产自然界没有的蛋白质,三、蛋白质工程的进展和前景,1、前景诱人：如用此技术制成的，具有、耗电少和 的特点。2、难度很大：主要是目前科学家对大多数蛋白质的 的了解还很不够。,电子元件,体积小,效率高,高级结构,1 关于生物体内存在的天然蛋白质，下列说法不正确的是（）A是生物在长期进化过程中形成的B它们的结构和功能符合特定物种生存的需要C构成天然蛋白质的氨基酸目前发现的有20种D一定完全符合人类生产和生活的需要,练习检测,D,练习检测,2蛋白质工程中直接需要进行操作的对象是（）氨基酸结构 B蛋白质空间结构 C肽链结构
26、D基因结构,练习检测,3下列关于蛋白质工程的说法错误的是（）A蛋白质工程能定向改造蛋白质分子的结构，使之更加符合人类的需要B蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构C蛋白质工程能产生出自然界中不曾存在过的新型蛋白质分子D蛋白质工程与基因工程密不可分，又被称为第二代基因工程,练习检测,4、以下关于蛋白质工程的说法正确的是（）A、蛋白质工程以基因工程为基础B、蛋白质工程就是酶工程的延伸C、蛋白质工程就是用蛋白酶对蛋白质进行改造D、蛋白质工程只能生产天然的蛋白质,练习检测,5、蛋白质工程的基本流程正确的是（）蛋白质分子结构设计DNA合成预期蛋白质功能根据氨基酸序列推出脱氧核苷酸序列A B C D,练习检测,6、蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出来的第二代基因工程，其结果产生的蛋白质是（）A氨基酸种类增多 B氨基酸种类减少C仍为天然存在蛋白质 D可合成天然不存在蛋白质,7、关于蛋白质工程的进展和应用，下列说法不正确的是（）A科学家通过对胰岛素的改造，已使其成为速效药品B生物和材料科学家正积极探索将蛋白质工程应用于微电子方面C蛋白质工程技术已经非常成熟，目前正被大力推广应用D蛋白质工程是一项难度很大的工程，目前成功的例子不多,练习检测,C,
