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1、猪瘟耐热活疫苗和猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的免疫与检测,西华大学生物工程学院 xxx,一、免疫程序,定义：一个地区(或单位)根据实际情况制定的合理的预防接种计划。即依据疫病在本地区流行情况及规律，畜禽的用途、年龄、母源抗体水平和饲养条件，使用疫苗的种类、性质、免疫途径,一、ELISA方法简介,1、ELISA的发展过程2、ELISA方法的现状3、ELISA方法的优点4、ELISA方法的缺点,1、ELISA的发展过程,关于ELISA,1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免
2、疫吸附测定法。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,2、ELISA方法的优点,1、检测灵敏度高，可达到ug/kg或ng/kg水平2、特异性强：抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果,3、对仪器设备要求不高，测定成本较低。4、方法快速、简便5、自动化程度高6、试剂保存时间较长7、方法种类较多8、无放射性同位数污染,4、ELISA方法的缺点,1、影响
3、因素较多，很容易造成结果失真。2、在酶免疫测定过程中，酶的底物和生色源或供氢体可能产生毒害效应,二、实验步骤,1、采样 该过程已由通威公司人员操作完成。,2、实验前的准备 通过查找资料确定实验步骤，对实验过程中的试剂用量进行计算。准备好实验所需要的仪器设备以及所需要各种试剂。,96孔板 对孔板进行标号,3、实验过程 按照实验步骤认真严格进行操作：（1）、抗原的稀释（2）、抗原包被（3）、PBSM的配制（4）、对孔板进行封闭（5）、一抗的配制（6）、加一抗,（7）、Pbst的配制（8）、配制二抗（9）、加二抗（10）、底物的配制（11）、加反应底物（12）、加终止液，反应停止（13）、用酶标仪进
4、行检测,（1）、抗原的稀释,用电子天枰称取1-2g抗原，加入一定的已经配制好的pbs溶液，将抗原稀释成2mg/ml的稀释溶液，取两个已经洗好的小烧杯，向其中加入20ml的pbs溶液，再从已经配制好的2mg/ml的抗原稀释液取出200ul，加入到小烧杯中，将抗原溶液再稀释100倍，配制成所需要的抗原稀释液。,（2）、抗原包被,取出已经准备好的ELISA板，96孔板按照标准100/well进行包被，用移液管吸取100ul加入到孔板的每一个孔当中在最后两列的倒数第三孔不加稀释液，留做对照。将已经加好的孔板放入到37摄氏度的恒温培养箱中进行反应2h。,（3）、PBSM的配制,用电子天平称取12mg的雀
5、巢奶粉，将奶粉加入到500ml的烧杯中，用量筒量取300ml的pbs溶液，加入到烧杯中，然后放到电炉上加热，煮沸脱脂，把煮沸的溶液放在自然条件下冷却，去脂，就配制成了4%的pbsm溶液，放入锥形瓶中待用,（4）、对孔板进行封闭,用PBS溶液洗版一次对孔板的封闭，是对整个孔没有结合抗原的部分进行封闭，就是用4%的pbsm填充整个小孔。然后将孔板放入37摄氏度的恒温箱中静置，反应1h。,（5）、一抗的配制,根据前面预实验的检测与分析，检测抗体时血清的最佳稀释浓度稀释比例应该在1:40合适，因此在这里采用稀释40倍的比例进行一抗的反应。用PBSM溶液将已经用甘油稀释2倍的血清溶液稀释到40倍注意：从
6、冰箱中取出血清溶液，必须将血清放在低温下，然后操作，这就需要将血清放在冰里面进行实验，在吸取不同的血清时，应当使用不同的枪头，防止交叉污染。,（6）、加一抗,当时间到了1h时，取出孔板，用pbs洗版一次，从培养箱中取出孔板，用已经配好的pbs溶液洗版一次，然后将孔板放拍打在卫生纸上，将其中的能够拍打出来的液体拍出。然后用移液管吸取已经配制好的一抗溶液按照准备阶段所设计的加血清方案进行加样，每孔100ul。加满以后放置37摄氏度的恒温箱中培养，1h。,（7）、Pbst的配制,取一个洁净的大烧杯，用量筒量取500ml的蒸馏水加入到烧杯当中，用移液枪吸取500ul的tween20，加入到蒸馏水当中，
7、混合均匀，将其加入到洗瓶当中，待用。,（8）、配制二抗,本实验使用的二抗是兔抗猪，查阅兔抗猪产品的说明书，本产品最适稀释比例为1:1000-1:5000。根据说明书以及通过老师经验确定二抗稀释度为：1：2000的稀释比例。用pbsm溶液 将二抗稀释到1:2000,（9）、加二抗,用pbst和pbs分别洗板两次，然后在卫生纸上拍板，然后用移液枪向孔板的每一个孔中加入已经配制好的二抗溶液，用移液枪吸取100ul加入到每一个孔当中，注意对照中，不加二抗的两孔用pbsm代替。加完二抗，将其放入37摄氏度的恒温箱中反应1h,（10）、底物的配制,底物采用TMB反应底物，用电子天枰称取6mg的TMB，加入
8、到1.5ml的ep管中，用移液管吸取1ml的DMSO加入到装有TMB得ep管中，让TMB溶解，待用。取一个烧杯，想其中加入45.5ml的水和4.5ml的醋酸钠溶液，再从ep管中吸取450ulTMB和DMSO的混合溶液加入到烧杯当中，再向烧杯中加入18ul的双氧水，配制成反应底物。注意，加入双氧水和向孔板中加入反应底物的时间不能太长。,（11）、加反应底物,用pbst和pbs分别洗版两次，然后在卫生纸上拍板，然后用移液枪吸取已经配制到得反应底物，每孔100ul，加入完毕后，将孔板放入避光处反应20分钟。,（12）、加终止液，反应停止,当反应过程中，取一个小烧杯，向其中倒入一定量的2M的硫酸溶液，
9、待用。当避光反应20分钟后，拿出孔板，观察颜色的变化，若蓝色变化明显，且不同的样品有颜色的深浅，就进行下一步的操作，如果蓝色很浅，甚至看不出有颜色，就让其放入避光出再反应几分钟，然后进行下一步的操作，符合颜色变化以后以后，用移液枪吸取已经准备好的硫酸溶液25ul加入到孔板的每一个孔中，终止反应。,（13）、用酶标仪进行检测,加终止液前，将酶标仪开关打开，让酶标仪预热，待用。将孔板放入酶标仪当中，在OD450nm下测定吸光度值。用电脑输出检测数据，计算效价。,4、结果处理 根据酶标仪在OD450nm下检测的实验结果，计算出如下数据：（1）、空白对照平均值（2）、标准差（S）（3）、2S（4）、阳
10、性值=x+2S（5）、平均值-阳性值0即为阳性,1号猪场,2号猪场,3号猪场,5、结果分析本实验采用ELISA方法检测猪血清中抗血清效价的测定，抗原（疫苗）直接包被ELISA板，抗血清（样品）与包被的抗原相互作用，再用二抗（兔抗猪Ig G/HRP）进行检测并显色。检测结果中，抗血清效价低于1:40的被认为是免疫失败。,从不同猪场来分析，三个猪场的免疫效果基本较好，其阳性比例相对较高。整体来说，仍有一定比例的猪没有免疫成功，分析原因有以下几种可能：1.免疫剂量不足，疫苗中病毒株免疫原性差；2.没有正确的保存和使用疫苗，没有严格的按照免疫程序进行免疫；3.猪当时的健康状况、生长的环境（过冷、过热、惊吓、脏乱、噪音等）都会影响到猪的免疫机能。,谢谢！,
