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1、固相析出分离技术,1.概念：通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以固体形式从溶液中沉淀析出的分离纯化技术。,2.种类,3.沉淀和结晶（晶体）的异同点,相同：在本质上同属一种过程（固相析出）,条件缓慢变化时，溶质分子有足够时间排列，有利于结晶形成；条件变化剧烈，强迫快速析出，溶质分子来不及排列就析出，形成无定形沉淀。,区别：,结晶法：高度的选择性（原因：只有同类分子 或离子才能排列成晶体）。沉淀法：浓缩与分离，但所得的沉淀物聚集多 种物质，或含有盐类，或包裹着溶剂。,分离效果,第四章沉淀分离法,沉淀法：利用某种沉淀剂或改变条件，使所需提取的物质或杂质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀
2、的过程。具有浓缩和分离的双重作用。在蛋白质、酶、多肽、核酸和其他细胞组分的回收和分离中应用的很多。,盐析沉淀法有机溶剂沉淀等电点沉淀法成盐沉淀法高分子聚合物沉淀选择性变性沉淀法,一、盐析沉淀法,盐析法：在高浓度中性盐存在下，欲分离物质在中性盐水溶液中的溶解度降低而产生沉淀。早在19世纪盐析法就被用于从血液中分离蛋白质，目前该方法仍广泛用来回收或分离蛋白质（酶）等生物大分子物质。,（一）基本原理 蛋白质的溶解特性取决于其组成、构象、周围环境的物理化学性质以及溶剂的可利用度。这些性质就本质而言是水分子间的氢键和蛋白质表面所暴露出的N、O原子的相互作用，所以易受溶液温度、pH值、介电常数和离子强度等
3、参数的影响。,蛋白质在自然环境中通常是可溶的，表面：大部分是亲水基团 内部：大部分是疏水基团,蛋白质呈稳定的分散状态,两性物质，一定pH下表面带有一定的电荷，静电斥力作用使分子间相互排斥,蛋白质周围的水分子有序排列，在表面形成水化膜，这一层能保护蛋白质粒子避免因碰撞而聚沉。,当向蛋白质溶液中加入中性盐时：,低盐-盐溶(低盐情况下，随着中性盐离子强度的增加，蛋白质溶解度增大),高盐-盐析(高盐浓度时，蛋白质溶解度随之减小),盐离子部分中和蛋白质的电性，使分子间排斥作用减弱,中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化作用从而使蛋白质脱去水化膜，暴露出疏水区域,H+,OH-,中性盐破坏水膜,蛋白
4、质的盐析机制示意图,蛋白质沉淀,蛋白质在水中的溶解度不仅与中性盐离子的浓度有关，还与离子所带电荷数有关，高价离子影响更显著。通常用离子强度表示对盐析的影响。,碳氧血红蛋白的lgS与(NH4)2SO4离子强度的关系,S0,(离子强度),lgS,盐析,盐溶,蛋白质溶解度,起始蛋白浓度,（二）无机盐的选择,在蛋白质盐析中，常用的盐析剂有(NH4)2SO4,Na2SO4，MgSO4，NaH2PO4，NaCl，Na3PO4,K3PO4。,(NH4)2SO4原因,廉价在水中溶解度大，且溶解度随温度变化小，低温下仍具有较大的溶解度对大多数蛋白质的活力无损害,常用盐析剂在水中的溶解度（g/100ml水）,盐析
5、效果：阴离子 阳离子尤其以高价阴离子更为明显。,阳离子对盐析效果的影响：Al3+H+Ba2+Sr2+Ca2+Cs+Rb+NH4+K+Na+Li+,无机盐可按两种方式加入溶液中：,直接加入固体(NH4)2SO4粉末工业生产(分批加入，充分搅拌)加入(NH4)2SO4饱和溶液实验室和小规模生产(防止溶液局部过浓，但加量较多时溶液会被稀释),（三）影响盐析的各种因素,无机盐的加入量蛋白质的浓度温度pH操作方式,1.无机盐加入量的影响,S0,(离子强度),lgS,盐析,蛋白质溶解度,不同蛋白质溶解度与离子强度的关系,蛋白质种类不同，盐析所用的无机盐量也不同,对于特定的蛋白质，一定操作条件下产生沉淀时的
6、无机盐浓度范围都是一定的，即具有一定的蛋白质盐析分布曲线。,蛋白质沉淀的速度可用-对盐饱和度（P）作图来表示：,dS,dP,蛋白质溶解度随(NH4)2SO4 饱和度而变化的速率,P,利用不同蛋白质盐析分布曲线在横轴上的位置不同，可采取先后加入不同量无机盐的办法来分级沉淀蛋白质。,2.蛋白质浓度的影响,蛋白质浓度不同，沉淀所需无机盐用量也不同。随浓度提高，盐用量减少。,分级沉淀：将溶液稀释，使重叠曲线拉开距离制取成品：提高蛋白质浓度,3.温度的影响,低盐浓度：温度升高，溶解度升高高盐浓度：温度升高，溶解度降低,温度适当提高有利于蛋白质沉淀。高温容易导致蛋白质变性。蛋白质盐析一般在室温下进行，某些
7、温度敏感性的蛋白质盐析最好在低温下进行。,4.pH的影响 蛋白质在pI时的溶解度最小，最容易从溶液中析出，因此选择在被盐析的蛋白质的pI附近。耗盐少，蛋白质收率也高,5.操作方式的影响,10,50 60 70 饱和度（%）,5,2.5,1,酶活性 U/ml,操作方式对延胡索酸酶盐析的影响,采用间歇方式所需盐量比连续方式少；间歇操作中，用饱和溶液的需盐量比用固体盐的高。,6.盐析法的优缺点,（1）优点：室温下沉淀物在硫酸铵盐析溶液中长时间放置不会失活，且无机盐不容易引起蛋白质变性失活；非蛋白的杂质很少被夹带沉淀；适用范围广，几乎所有蛋白质和酶都能采用 设备简单，操作方便。,（2）缺点：沉淀物中含
8、有大量盐析剂 硫酸铵容易分解产生氨的恶臭味，产品不能直接用于医药上,盐析法可以作为初始的提取方法，再与多种精制手段结合起来，如采用超滤、凝胶色谱、透析等方法将无机盐去除，就可制得高纯度产品。,二、有机溶剂沉淀法,在蛋白质等生物大分子的水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，能显著降低蛋白质等生物大分子的溶解度，使其沉淀析出。不同蛋白质沉淀时所需有机溶剂的浓度不同，因此调节有机溶剂的浓度，可以使混合物中的蛋白质分段析出，达到分离纯化的目的。不仅适于蛋白质的分离纯化，还常用于酶、核酸、多糖等的分离纯化。,（一）基本原理,加入有机溶剂后，会使系统（水和有机溶剂的混合液）的介电常数减小，而使溶质分子（如蛋
9、白质分子）之间的静电引力增加，从而促使它们互相聚集，并沉淀出来。水溶性有机溶剂的亲水性强，它会抢夺本来与溶质结合的自由水，使其表面的水化层破坏，导致溶质分子之间的相互作用增大而发生凝聚，沉淀析出。,常用于生物大分子沉淀的有机溶剂：甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮等，其中乙醇是工业上最常用的,（二）影响沉淀效果的因素,温度pH中性盐浓度金属离子,1.温度的影响,有机溶剂存在下，多数蛋白质的溶解度随温度降低而显著的减小，因此低温下（最好低于0oC）沉淀得完全，有机溶剂用量可减少。实际操作中：有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的温度显著升高，从而增加对蛋白质的变性作用。,整个操作过程应在低温下进行
10、。具体操作时：将待分离溶液和有机溶剂分别进行预冷：蛋白质溶液冷却到0oC左右，有机溶剂预冷到-10oC以下 为避免温度骤然升高损失蛋白质活力，操作时应不断搅拌、少量多次加入。使沉淀在低温下短时间处理后即进行过滤或离心分离，接着真空抽去剩余溶液或将沉淀溶入大量缓冲溶液中以稀释有机溶剂，旨在减少有机溶剂与目的物的接触。,温度的控制应根据蛋白质的稳定性而不同，稳定性较差的物质，冷却至低温是必要的；但对于稳定性较好的物质，如淀粉酶，温度不需过低，10-15oC。,2.pH的影响,在等电点时蛋白质溶解度最低，因此有机溶剂沉淀时溶液pH多控制在蛋白质等电点附近。pH的控制必须考虑蛋白质的稳定性：某些酶的等
11、电点在pH4-5之间，比其稳定的pH范围低，因此pH应首先满足蛋白质稳定性的条件。控制pH时应使大多数蛋白质分子带相同电荷，不要让目的物与主要杂质分子带相反电荷，以免共沉。,3.无机盐的离子强度,少量的中性盐能够减少蛋白质变性。在有机溶剂沉淀时中性盐浓度以0.01-0.05 mol/L为宜。常用中性盐:乙酸钠、乙酸铵、氯化钠 中性盐浓度较高时（0.2 mol/L以上），由于盐溶作用会增大蛋白质的溶解度，此时需增加有机溶剂的用量才能使沉淀析出。对盐析后的上清液或沉淀物，如进一步用有机溶剂沉淀法纯化，必须先脱盐。,4.金属离子,一些金属离子，如Ca2+、Zn2+能与蛋白质结合形成复合物，使蛋白质溶
12、解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成，并减少有机溶剂用量。使用时避免能与这些金属离子形成难溶盐的阴离子存在（如磷酸根）。常用的锌盐：醋酸锌或硫酸锌,5.有机溶剂沉淀法的优缺点,（1）优点：乙醇等有机溶剂易挥发除去，不会残留于成品中，产品更纯净（不需要脱盐处理）；有机溶剂密度低，沉淀物与母液间的密度差较大，分离容易，适于用离心分离收集沉淀物。,（2）缺点：容易使蛋白质变性，操作需要在低温下进行，使用上有一定的局限；采用大量有机溶剂，成本较高。为节省用量，通常将蛋白质溶液适当浓缩，并回收溶剂。有机溶剂易燃易爆，工业生产上车间和设备都应有防护措施。,等电点沉淀法成盐沉淀法高分子聚合物沉淀选择
13、性变性沉淀法,三、其他沉淀方法,1.等电点沉淀法 两性物质在pH=pI时，分子表面净电荷为零，分子间静电排斥作用减弱，因此吸引力增大，能相互聚集，发生沉淀。不同的两性物质，pI不同，如不同蛋白质。根据这一特性，用依次改变溶液pH的方法可将不同的蛋白质分别沉淀析出，达到分离纯化的目的。,只适用于水化程度不大、在pI时溶解度很低的两性物质，如酪蛋白。对于亲水性很强的两性物质，在pI及pI附近仍有相当的溶解度，用该法沉淀不完全，而且许多生物分子的pI很接近，因此很少单独使用。往往与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法结合起来。采用该法时必须注意：溶液pH不会影响到目的物质的稳定性。,等电点沉淀法可用
14、于所需物质的提取，也可用于沉淀除去杂蛋白及其他杂质，实际工作中普遍采用该方法作为去杂手段。如在工业上生产胰岛素时：先调pH至8.0去除碱性杂蛋白，再调pH至3.0去除酸性杂蛋白。粗酶液经过这样的处理后纯度大大提高，有利于后面的操作。,2.成盐沉淀法,某些生化物质（如核酸、蛋白质、多肽、氨基酸、抗生素等）能和重金属、某些有机酸及无机酸形成难溶性的盐类复合物而沉淀。,注意：形成复合盐后，常使蛋白质发生不可逆的沉淀，应用时必须谨慎。,（1）金属离子沉淀法 许多有机物（包括蛋白质）在碱性溶液中带负电荷，因此能与金属离子形成金属复合盐沉淀。,根据与有机物作用的机制不同，可将金属离子分为三类：,能与羧基、
15、含氮化合物和含氮杂环化合物结合，如Mn2+,Fe2+,Co2+,Ni2+,Cu2+,Zn2+等 能与羧基结合，但不能与含氮化合物结合，如Ca2+,Ba2+,Mg2+,Pb2+等 能与巯基结合，如Hg2+,Ag+,Pb2+等,分离出沉淀物后，如何去除金属离子？可用H2S使金属变成硫化物而除去，也可采用离子交换法或金属螯合剂EDTA等将金属离子除去。金属离子沉淀法除提取生化物质外，还能用于沉淀去除杂质：如锰盐能选择性的沉淀发酵液中的核酸，降低发酵液黏度，以利于后续操作；ZnSO4能沉淀红霉素发酵液中的杂蛋白以提高过滤速度。,（2）有机酸沉淀法（有机酸：具有酸性的有机化合物）某些有机酸如苦味酸、苦酮
16、酸、鞣酸和三氯乙酸等，能与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉淀析出。这些有机酸与蛋白质形成盐复合物沉淀时，常发生不可逆的沉淀反应，所以用此法制备蛋白质和酶时，需采用较温和的条件，有时还加入一定的稳定剂，以防止蛋白质变性。,鞣酸（单宁）多元酚类化合物 分子上有羧基和多个羟基，蛋白质分子中有氨基、亚氨基和羧基，所以可与单宁分子形成为数众多的氢键而结合在一起，生成巨大的复合颗粒而沉淀下来。如何使蛋白质游离释放出来？单宁与蛋白质的结合比较牢固，不易分开，多采用竞争结合法：用比蛋白质更强的结合剂与单宁结合，竞争性结合剂有PVP（与单宁形成氢键的能力很强），聚乙二醇、聚氧化乙烯、山梨糖醇甘油酸酯,三氯乙酸
17、（TCA）沉淀蛋白质迅速且完全，一般会引起变性。低温下短时间作用可使某些较稳定的蛋白质或酶保持原有活力，多用于目的物较稳定且分离杂蛋白相对困难的场合。,雷凡诺吖啶染料 沉淀机制比一般有机酸盐复杂，但与蛋白质作用也主要是通过形成盐的复合物而沉淀的。提纯血浆中-球蛋白有较好效果。,（3）无机酸沉淀法（无机酸：能解离出氢离子的无机化合物，如硫酸、盐酸、硝酸、次氯酸等；有机酸：具有酸性的有机化合物，最常见是羧酸）某些无机酸如磷钨酸、磷钼酸等能与阳离子形式的蛋白质形成溶解度极低的复合盐，使蛋白质沉淀析出。无机酸如何去除？得到沉淀物后，可在沉淀物中加入无机酸并用乙醚萃取，把磷钨酸、磷钼酸等移入乙醚中除去；
18、或用离子交换法除去。,3.高分子聚合物沉淀,某些水溶性的非离子型高分子聚合物是20世纪60年代发展起来的沉淀剂，近年来被广泛用于核酸、蛋白质和酶的分离纯化，包括不同分子量的聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和葡聚糖等。应用最多的是PEG，原因：无毒，对成品影响小,（1）用水溶性非离子聚合物沉淀生物大分子和颗粒的两种方法：选用两种水溶性非离子多聚物组成液-液两相系统，使生物大分子或颗粒在两相系统中不等量分配，进行分离。机理：不同生物分子和颗粒表面结构不同，有不同分配系数；且外加离子强度、pH和温度等的影响，提高分离效果。,选用一种水溶性非离子多聚物，使生物大分子或颗粒在同一液相中，由于
19、被排斥相互凝集而沉淀析出。,（2）PEG的沉淀 机理 劳兰梯提出：通过空间位置排斥，使液体中的生物大分子、病毒和细菌等微粒被迫挤聚在一起而引起沉淀的发生。影响因素,PEG浓度：PEG相对分子质量：离子强度：蛋白质相对分子质量：pH：温度：,与溶液中盐的浓度成反比,越接近蛋白质的pI，所需PEG浓度越低,高分子量的PEG沉淀效果较好,分子量越高，PEG越少,优缺点 优点：无毒，对成品影响小，所以广泛用于核酸、蛋白质、酶等的沉淀分离。缺点：所得沉淀中含有大量PEG,吸附法,4.选择性变性沉淀法 破坏杂质，保存目的物。原理：利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感性不同，从而有选择的
20、使之变性沉淀，分离纯化。,表面活性剂或有机溶剂引起变性利用对热的稳定性不同酸碱变性,利用表面活性剂或有机溶剂变性。如：制备核酸时，加入含水酚、氯仿、SDS等选择性的使蛋白质变性沉淀，从而与核酸分离。利用对热的稳定性不同，加热破坏某些组分，保留另一些组分。如 热稳定性:DNase RNase，加热可使DNase变性沉淀。简单可行，制备热稳定的小分子物质过程中，对于除去大分子蛋白质和核酸有效。,选择性的酸碱变性 如：用2.5%的TCA处理胰蛋白酶、抑肽酶或细胞色素c的粗提液，均可除去大量杂蛋白，而对所提取的酶活性无影响。有时把酸碱变性和热变性结合起来，效果更好,沉淀分离法,课堂总结,盐析沉淀法有机溶剂沉淀等电点沉淀法成盐沉淀法高分子聚合物沉淀选择性变性沉淀法,原理、无机盐的选择（(NH4)2SO4）、影响因素（5个）、优缺点,原理、常用（甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮）、影响因素（4个）、优缺点,原理、使用时注意事项,金属离子沉淀法：3类有机酸沉淀法：常用有机酸无机酸沉淀法：常用无机酸,常用沉淀剂、影响PEG沉淀效果的因素、如何去除沉淀中的PEG,3种方法,课后题,1.使用等电点沉淀法、成盐沉淀法和选择性变性沉淀法各应注意什么问题?2.PEG沉淀效果的影响因素有哪些？如何去除蛋白质沉淀中的PEG?,
