《沉淀技术》PPT课件.ppt

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1、现代生化分离技术Separation Methods in Biochemistry,2,第三章 沉淀技术,第三章 沉淀技术,3,第三章 沉淀技术,第一节 概述,沉淀是溶液中的溶质有液相变成固相析出的过程，表示一个新的凝结相的形成过程，或由于加入沉淀剂使某些离子成为难溶化合物而沉积的过程。是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低、生成固体凝聚物的现象。沉淀VS结晶，本质上同一种过程。同类分子或离子以有规则排列形式析出结晶；以无规则的紊乱排列形式析出沉淀。,3.1.1 沉淀的定义,4,第三章 沉淀技术,3.1.2 沉淀的类型：,晶形沉淀：颗粒最大，其直径大约在0.11 m之间。在沉淀内部，离子按晶体

2、结构有规则地进行排列，因而结构紧密，整个沉淀所占的体积较小，极易沉降于容器底部。凝乳状沉淀：颗粒大小介于上述二者之间，其直径大约为0.021 m，因此其性质也介于二者之间。无定型沉淀：颗粒最小，其直径大约在0.02 m以下。沉淀内部离子排列杂乱无章，并且包含有大量水分子，因而结构疏松，体积庞大，难以沉降。,5,第三章 沉淀技术,沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，目前仍广泛应用在工业上和实验室中。由于其浓缩作用常大于纯化作用，因而沉淀法通常作为初步分离的一种方法，用于从去除了菌体或细胞碎片的发酵液中沉淀出生物物质，然后再利用色层分离等方法进一步提高其纯度。沉淀法由于成本低、收率高、浓缩倍

3、数高可达l0-50倍和操作简单等优点，是下游加工过程中应用广泛的值得注意的方法。缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强,3.1.3 沉淀技术的应用特点,6,第三章 沉淀技术,第二节 沉淀方法的分类,盐析有机溶剂沉淀等电点沉淀非离子多聚物沉淀聚电解质沉淀法高价金属离子沉淀法热沉淀法,7,第三章 沉淀技术,盐析法蛋白质在水溶液中的溶解度受盐浓度影响,1、基本原理,蛋白质表面特性,蛋白质溶解：相似者相溶亲水性和疏水性：有利因素：亲水性，包括氢键、极性基团、离子化侧链、亲水蛋白所占的%等。如白蛋白不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基团、疏水蛋白所占的%等。如纤维蛋白原。,8,第三章 沉淀技术,蛋

4、白质和酶均易溶于水，因为该分子的COOH、NH2和OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。,9,第三章 沉淀技术,盐溶,原理：大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。蛋白质分子吸附盐类离子后，带电表层使蛋白质分子彼此排斥（同性相斥）；而蛋白质与水分子的相互作用却加强，溶解性增大。,10,第三章 沉淀技术,盐析（破坏水化膜、中和电荷）,1

5、、继续增大中性盐离子强度时大量的盐夺取了自由水，将其转变为盐离子的水化水蛋白质胶体外层的水化膜因盐的夺取而遭到破坏蛋白质胶体表面的疏水区域暴露出来，彼此相互聚集，沉淀；,11,第三章 沉淀技术,2、加入高浓度中性盐后，盐离子与生物分子表面的带相反电荷的离子基团结合，中和了生物分子表面的电荷，降低了生物分子与水分子之间的相互作用，此时生物分子很容易相互聚集，在溶液中的溶解度降得很低，从而形成沉淀从溶液中析出。,12,第三章 沉淀技术,小结原理1.高浓度盐离子使蛋白质表面双电层厚度降低，静电排斥作用减弱.2.中性盐比蛋白质具更强的亲水性，因此将与蛋白质争夺水分子.,13,第三章 沉淀技术,2、盐析

6、公式及讨论,蛋白质溶解度与溶液中离子强度关系：lgS=-ksI S，蛋白质溶解度（g/L）I0.5MK2SO4的离子强度I(0.5 2 12+0.5 22)/2=1.5。1MNaCl的离子强度(1 12+1 12)/2=1 为常数，I=0时的lgSks为盐析常数，与盐性质（离子价数、离子半径等）、蛋白结构有关，ks越大，盐析效果越好（S越小，越易沉淀）,14,第三章 沉淀技术,讨论,1、KsI项Ks与溶液的pH、温度无关，仅取决于蛋白质的性质和盐的种类。盐浓度离子强度IS析出。,lgS=-ksI,15,第三章 沉淀技术,2、值的特性及对盐析的影响,表示不外加盐时的理想溶解度S，受到温度、pH的

7、影响；pH的影响：在pI时最小（调节pH可以导致蛋白质净电荷数变化）温度的影响：高离子强度溶液中，温度升高一般使下降（温度升高利于盐的溶解，夺取更多的水分子，使蛋白质溶解性更差）,lgS=-ksI,16,第三章 沉淀技术,3、分段盐析,ks分段盐析：固定蛋白质的pH、T（）,变动离子强度I达到沉淀的目的。分段盐析：在一定的离子强度下（I），改变溶液的pH、T，达到沉淀的目。Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理（蛋白质粗品的分级沉淀）。盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。,lgS=-ksI,17,第三章

8、 沉淀技术,3、盐析操作要点,3.1 无机盐的挑选原则,高溶解度，能配置高离子强度的盐溶液；溶解度受温度的影响小；盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离；不易引起蛋白质的变性；价格低廉；,18,第三章 沉淀技术,通常采用中性盐，最常用（NH4）2SO4，优点：1、溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（04）进行。硫铵在0时的溶解度70.6g/100mL，Na2SO4-4.9,NaH2PO4-1.6,3.2 盐的选择,19,第三章 沉淀技术,2、不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋

9、白质用23mol/L浓度的（NH4）2SO4保存可达数年之久。3、次常用Na2SO4。缺点：在30以下溶解度较低，主要用于热稳定蛋白。,20,第三章 沉淀技术,3.3 盐析的操作与应用,3.3.1 盐析的操作方法,盐的处理,硫酸铵使用时要求纯度较高，生产时为降低成本，一般选用化学纯的硫酸铵，在使用前应进行预处理，可通过化学法将重金属除去（如通入H2S后过滤），再将硫酸铵重结晶备用。,21,第三章 沉淀技术,加盐的方法,固体硫酸铵加入法（需要量大时）。将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。加入饱和

10、硫酸铵溶液法（需要量小时）。,22,第三章 沉淀技术,3.3.2 盐析的影响因素,蛋白质的种类 蛋白质的种类不同，Ks值会有所不同；分子量越大，沉淀所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀。,23,第三章 沉淀技术,不同浓度的蛋白质溶液产生沉淀所要求的临界盐浓度不同。高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀，若蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质的共沉淀作用。低浓度的蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降低。较适中的蛋白质浓度是2.53.0，相当于25 mg/mL30mg/mL。,蛋白质的浓度,24,第三章 沉淀技术,pH值对盐析的影响,在等电点处溶解度小，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。,2

11、5,第三章 沉淀技术,温度的影响,对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。一般情况下，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在04下操作，以避免活力丧失。,26,第三章 沉淀技术,无机盐种类 阴离子盐析作用顺序柠檬酸盐PO43SO42CH3COOClNO3SCN阳离子盐析作用顺序（一价）NH4+K+Na,(NH4)2SO4,27,第三章 沉淀技术,3.3.3 沉淀的再溶解,12倍沉淀体积的下一步所用缓冲液溶解不溶时可能是变性蛋白质或杂质，离心除去。,28,第三章 沉淀技术,

12、3.3.4 脱盐,透析超滤凝胶过滤层析,29,第三章 沉淀技术,有机溶剂沉淀法,定义 向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法，称为有机溶剂沉淀法。,30,第三章 沉淀技术,（1）静电作用：降低水溶液的介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，带电的蛋白质溶质分子之间库仑引力增强，使其相互吸引而聚集，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。,1、原理,31,第三章 沉淀技术,（2）脱水作用,由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子

13、的水膜，因而发生沉淀作用。较静电作用占更主要的地位。,32,第三章 沉淀技术,2、影响有机溶剂沉析的因素,（一）温度,多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此必须预冷，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。,33,第三章 沉淀技术,（二）样品浓度,样品较稀时，将增加有机溶剂投入量和损耗；样品太浓会增加共沉作用。一般认为蛋白质的初浓度以0.52%（5 20mg/mL）为好，多糖则以12起始较合适。,34,第三章 沉淀技术,（三）pH值,选择在样品

14、稳定的pH值范围内，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。,35,第三章 沉淀技术,（四）离子强度,少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。盐浓度太大或太小都有不利影响，通常盐浓度以不超过5%为宜，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的2倍体积为宜。,36,第三章 沉淀技术,3、有机溶剂沉淀法的应用,（一）有机溶剂沉析的特点优点：分辨能力比盐析高,即一种生物分子或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉析；沉析不用脱盐，过滤比较容易。缺点：是某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作

15、需在低温下进行。,37,第三章 沉淀技术,（二）应用,有机溶剂沉析技术经常用于蛋白质、酶，多糖和核酸等生物大分子的沉析分离。使用时先要选择合适的有机剂，然后注意调控样品的浓度、温度、pH和离子强度，使之达到最佳的分离效果。沉析所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉析物，减少其中有机溶剂的含量，如若必要可以装透析袋透析脱除有机溶剂，以免影响样品的生物活性,38,第三章 沉淀技术,实例,39,第三章 沉淀技术,等电点沉淀法,1、原理,调节两性生化物质溶液的pH值，以达到某一生化物质的等电点，使其从溶液中沉淀析出而实现分离的技术称为等电点沉析技术。等电点(pI)是两性物质

16、在其质点的净电荷为零时介质的pH值,溶质净电荷为零，分子间排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来，沉淀析出，此时溶质的溶解度最低,40,第三章 沉淀技术,特点 等电点沉淀法操作十分简单，试剂消耗少，给体系引入的外来物也少，是一种有效的蛋白质初级分离方法，尤其对疏水性较强的蛋白质。其主要优点在于很多蛋白质的等电点都在偏酸性范围内，而无机酸通常价格低廉，因此可以省去除酸的步骤。,41,第三章 沉淀技术,2、应用,在生化产品的分离纯化过程中，常利用两性物质如氨基酸、蛋白质、多肽、酶、核酸等具有不同的等电点的特性来进行产品的分离纯化。由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍

17、有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。,42,第三章 沉淀技术,3、实例,从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI8.9，可先于pH 3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3O)。工业生产胰岛素(pI5.3)时，先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调pH 4.0后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。用pH 9.0的0.1 mol/L Tris-HCl

18、缓冲液重新溶解，加入2040%饱和度的硫酸铵分级，离心收集的沉淀Tris-HCl缓冲液再次沉淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶。,43,第三章 沉淀技术,水溶性非离子型聚合物沉淀法,定义 许多水溶性非离子型聚合物，特别是PEG可用来进行选择性沉淀以纯化蛋白质。原理 聚合物的作用认为与有机溶剂相似，能降低水化度，使蛋白质沉淀。此现象和两水相的形成有联系。使低分子量的蛋白质沉淀，需加入大量PEG：而使高分子量的蛋白质沉淀，加入的量较小。,44,第三章 沉淀技术,常用的非离子型多聚物：不同分子量的聚乙二醇（PEG）和葡聚糖,PEG：亲水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量（聚合程度）,45

19、,第三章 沉淀技术,PEG是一种特别有用的沉淀剂，因为无毒，不可燃性且对大多数蛋白质有保护作用。PEG沉淀法能在室温下进行，得到的沉淀颗粒较大，收集容易。PEG的分子量需大于4000，最常用的是6000和20 000。所用的PEG浓度通常为20，浓度再高，会使粘度增大，造成沉淀的回收比较困难。PEG对后续分离步骤，影响较少，因此可以不必除去。但它的存在会干扰A280和Lowry法测定蛋白质,46,第三章 沉淀技术,优点：室温条件下操作；沉淀的颗粒往往比较大；不容易破坏蛋白质活性。缺点：所得的沉淀中含有大量的PEG,47,第三章 沉淀技术,其他沉析技术,一、成盐沉淀法,金属离子沉淀法：蛋白质在碱

20、性溶液中带负电荷，能与金属离子形成金属复合盐沉淀。常用的金属离子Zn2+、Ca2+、Pb2有机酸沉淀法：含氮有机酸如苦味酸和鞣酸等能够与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉淀析出。无机酸沉淀法：磷钨酸、磷钼酸等能与阳离子形式的蛋白质形成溶解度极低的复合盐，从而使蛋白质沉淀析出特点：常使蛋白质发生不可逆的沉淀，应用时必须谨慎。,48,第三章 沉淀技术,二、选择性变性沉淀法,选择变性沉析法原理是利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感性不同，而有选择地使之变性沉析，以达到目的物与杂蛋白分离的技术，称为选择变性沉淀。1、选择性热变性：适用对象：热稳定性高的蛋白质2、选择性酸碱变性 3、

21、选择性变性剂,49,第三章 沉淀技术,实例,酵母干粉中加入0.066 mol/L磷酸氢二钠溶液，37水浴保温2 h，室温搅拌3 h，离心收集上清液，升温至55，保温20 min后迅速冷却离心去除热变性蛋白，上清液中多为热稳定性较高的醇脱氢酶。,50,第三章 沉淀技术,CTAB(十六烷基三甲基季铵盐溴化物)与多糖上的阴离子形成形成季铵络合物，降低离子强度，络合物析出。酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸则存在于水溶液中。,51,第三章 沉淀技术,第三节 沉淀技术的应用,3.3.1 蛋白质,蛋白质（酶）的纯化在粗分离阶段常用到沉淀技术，以盐析、有机溶剂沉淀、多聚

22、物沉淀的应用最广泛。,52,第三章 沉淀技术,棉铃虫谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）的纯化聚乙烯亚胺（PEI）+硫酸铵+PEG+亲和层析，棉铃虫幼虫中的GSTPEG10000PEG20000(NH4)2SO4 多种沉淀技术的结合使用,53,第三章 沉淀技术,-甘露聚糖酶（-mannanase）枯草芽孢杆菌发酵丙酮沉淀/(NH4)2SO4/PEG比较后丙酮最佳 不同沉淀技术的比较,54,第三章 沉淀技术,3.3.2 核酸,核酸的高电荷磷酸骨架（3-）比蛋白质，多糖等更具亲水性PEG应用于DNA沉淀已普遍（0.01M 磷酸缓冲液中PEG浓度10%）酚、氯仿抽提后（变性蛋白质），乙酸钠中和磷酸骨架负电荷（降低其亲水性，促聚集），乙醇可有效沉淀DAN（有机溶剂沉淀）分子克隆第三版,55,第三章 沉淀技术,3.3.3 多糖,多糖提取的初级阶段多用到乙醇沉淀或乙醇分级沉淀，选择性沉淀（TCA）去除多糖中的蛋白质杂质。教材例子,