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1、色谱分离法,第一节 概述,色谱法简介 色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。,在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相；自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相；装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱。,第一节 概述色谱分离（Chromatographic Res
2、olution，CR）利用多组分混合物中各组分物理化学性质（如吸附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲合力、分配系数等）的差别，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中。当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理化学性质的差别，而以不同的速率移动，使之分离。,分离效率高，每米柱长可达几千至几十万的塔板数；应用范围广，从极性到非极性、离子型到非离子型、小分子到大分子、无机到有机及生物活性物质，以及热稳定到热不稳定的化合物，尤其是对生物大分子样品的分离，是其他方法无法代替的；选择性强；高灵敏度的在线检测，可采用不同的高灵敏度检测器进行连续的在线检测；快速分离；过程自动化操作。,优点,1.按分离机
3、理不同分类,第二节、色谱分离的分类,吸附色谱分离（Adsorption Chromatography，AC）分配色谱（Distribution Chromatography，DC）离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography，IEC）凝胶色谱（Gel Chromatography，GC）亲合色谱（Affinity Chromatography，AFC）,吸附色谱分离是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。,新的吸附色谱技术有：疏水作用色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography
4、，HIC）、金属螯合作用色谱（Metal Chelation Chromatography，MCC）、共价作用色谱（Covalent Interaction Chromatography，CIC）等；,吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙、氧化钛、氢氧化锌凝胶等。,无机吸附剂在有机大分子色层分离中的实用例子丝裂霉素的精制。,丝裂霉素的发酵滤液用活性炭吸附，丙酮洗脱，蒸去丙酮的浓缩水溶液，用氯仿萃取。氯仿萃取液上氧化铝柱，先用氯仿冲洗，能部分分带，接着以氯仿丙酮（3:2）展开，约2小时后，能分出色层，其中蓝紫色色带为有效成分丝裂霉素C。将柱推出，切取蓝紫色部分，用10甲醇氯仿洗脱，减压蒸
5、干，在甲醇苯中结晶，即可得蓝紫色丝裂霉素C结晶。,分配色谱是利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。,根据固定相和流动相的极性与非极性的差别，分配色谱可分为正相色谱和反相色谱。正相色谱（Normal Phase Chromatography，NPC）的固定相为极性，流动相为非极性，当混合物随流动相通过固定相时，极性较强的化合物被保留，极性较弱的化合物先被洗脱下来。反相色谱（Reversed Phase Chromatography，RPC），固定相为非极性，流动相为极性，用于分离非极性或弱极性物质。,离子交换色谱是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆
6、交换，由于混合物中不同溶质对交换剂具有不同的亲合力而将它们分离。,该法适合于离子和在溶剂中可发生电离的物质的分离。,大多数生物大分子都是极性的，都可使其电离，所以离子交换色谱广泛用于生物大分子的分离纯化，特别是在蛋白质、多肽、核酸等生物物质的分离纯化中，离子交换色谱分离占主导地位。,碱性水溶性抗生素的分离和分析也常用离子交换色层分离法。,例,卡那霉素A,B,C可以用强碱性树脂Dowex12（OH型），以水作展开剂，进行离子交换色层分离法分离。,在0.939cm的色层分离柱中（树脂用量2550 mL，粒度200400目），流速控制在2030 mL/h，卡那霉素B最先流出，接着卡那霉素C，最后卡那
7、霉素A自柱中流出。,凝胶色谱以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子大小不同而进行分离的色谱技术，又称为分子筛色谱（Molecular Sieve Chromatography，MSC）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，SEC）。,凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子。当混合物随流动相流经凝胶柱时，较大的分子不能进入所有的凝胶网孔而受到排阻，它们将与流动相一起首先流出，较小的分子能进入部分凝胶网孔，流出的速度较慢，更小的分子能进入全部凝胶网孔，而最后从凝胶柱中流出。,凝胶色谱主要用于脱盐、
8、分级分离及分子量的测定。,应用举例,（1）去热原（2）纯化青霉素（3）大分子物质的分子量测定,将离子交换树脂制备的无盐水通过羟型DEAE-A-25凝胶，可制得无热原水，用于注射。,用葡聚糖凝胶G-25（粒度为2080m）分离青霉素中的一些高分子杂质（青霉素聚合物、青霉噻唑蛋白），去除这些强烈致敏性的全抗原。,生物体中许多大分子化合物具有与其结构相对应的专一分子可逆结合的特性，如酶蛋白与辅酶、抗原和抗体、激素与其受体、核糖核酸与其互补的脱氧核糖核酸等体系，把与目的产物具有特异亲合力的生物分子固定化后作为固定相，当含有目的产物的混合物（流动相）流经此固定相时，即可把目的产物从混合物中分离出来。,亲
9、合色谱对于生物大分子化合物的分离纯化具有特别重要的意义。,生物亲和关系,柱色谱，具有进样量大，回收容易等优点，但其分辨率不如纸上色谱和薄层色谱高；纸上色谱，以滤纸为载体，是以滤纸纤维及其结合水作为固定相，以有机溶剂作为流动相的分配色谱分离。纸上色谱分离具有设备简单、操作方便、分离效率高、所需样品量少等优点，但分离量少、回收困难，分离速度慢等；薄层色谱分离，将固定相在玻璃平板上铺成薄层而进行分离的一种分离技术。薄层色谱是柱色谱和纸上色谱两者的结合。,2.按固定相形状不同分类,3.按照展开程序分类 按照展开程序的不同，可将色谱法分为洗脱法、顶替法和迎头法。,洗脱法也称冲洗法。工作时，首先将样品加到
10、色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。流出曲线下图。,这种方法能使样品的各组分获得良好的分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂后，可获得纯度较高的物质。目前，这种方法是色谱法中最常用的一种方法。,顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相。很明显，吸附或溶解能力最弱的组分最先流出，最强的最后流出。顶替法的流出曲线如下图。,此法
11、适于制备纯物质或浓缩分离某一组分；其缺点是经一次使用后，柱子就被样品或顶替剂饱和，必须更换柱子或除去被柱子吸附的物质后，才能再使用。,第三节.生物工程中色谱分离,电泳和色谱是目前两种最好的分离方法 电泳不能用于生产规模一 色谱的分离规模1.色谱分析：10mg2.半制备（中等规模制备）：10-50mg3.制备（样品制备）：0.1-10g4.工业生产：20g/d 干扰素：1万元/1mg，年产值达1亿元,（二）色谱分离方法的选择,初级代谢产物 氨基酸、核苷酸、单糖类、脂肪酸 次级代谢产物 生物碱、糖苷、色素、抗生素 生物大分子 蛋白质、酶、多肽、核酸、多糖等,对于蛋白质、酶、核酸等生物大分子，由于它
12、们分子量大、易失活以及具有生物专一和亲合性等特点，选用多糖基质（如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等）离子交换色谱、疏水作用色谱、凝胶色谱和亲合色谱等；对于生物小分子的代谢物，由于它们分子量小、结构和性质比较稳定、操作条件不太苛刻，采用吸附、分配和离子交换色谱进行分离较为适宜。,二、色谱分离方法的选择,氨基酸、有机酸、核苷酸等一些离子型化合物的生产多用离子交换色谱分离；抗生素、生物碱、萜类、色素等次级代谢产物多采用吸附色谱或反相分配色谱分离。,第四节.色谱分离的基本原理,各组分和固定相存在一定的化学亲和力 移动速度低于流动相 各组分和固定相的亲和力大小不同 各组分移动速度不同 展开（Developmen
13、t）洗脱液（Eluate）色谱（Chromatography）,（一）分配色谱,（一）分配系数K和分配比k1.分配系数K 分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次的分配过程，这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数K。它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即 K=溶质在固定相中的浓度/溶质在流动相中的浓度=Cs/Cm,分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的，它是每一个溶质的特征值，它仅与两个变量有关：固定相和温度。与两相体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关。,阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和
14、标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比,其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小,2.分配比 k 分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即 k=组分在固定相中的质量/组分在流动相中的质量=ms/mm,k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。k=ms/mm=CsVS/CmVm 式中cs,cm分别为组分在固定相和流动相
15、的浓度；Vm为柱中流动相的体积，近似等于死体积。Vs为柱中固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。,例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。分配比 k 值可直接从色谱图中测得 k=(trt0)/t0=tr/t0=Vr/V0 4.分配系数K与分配比 k 的关系 K=k.,2 色谱法分类,2.1 按色谱过程的机理分类吸附色谱：利用各组分在吸附剂与洗脱剂之间的吸附和溶 解（解吸）能力的差异而达到分离的。分配色谱：利用各组分在两种互不混溶溶剂间的溶解度差异来达到分离的。离子交换色谱：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同 而达到分离的一种色谱方法。凝
16、胶色谱（排阻色谱）：利用惰性多孔物，如凝胶，对不 同组分分子的大小而产生不同的滞留作用，以达到分离的色谱方法。亲和色谱：利用生物大分子和固定相表面存在某种特异亲和力，进行选择性分离的一种方法,2.2 按固定相所处的状态分类柱色谱：将固定相颗粒装填在金属或玻璃 柱内进行色谱分离。纸色谱：利用滤纸作为固定相进行色谱分离。薄层色谱：把吸附剂粉末做成薄层作为固定相进行色谱分离。,3 柱色谱,柱色谱（Column Chromatography）是最常见的色谱分离形式，茨维特的色谱实验是一个典型例子。它具有高效、简便和分离容量较大等特点，常用于复杂样品分离和精制化合物的纯化。,柱色谱主要有吸附色谱和分配色
17、谱两类。前者常用氧化铝或硅胶为柱填料。后者以硅胶、硅藻土和纤维素为支持剂，以吸收一定量的特殊液体作为固定相。,3.1 吸附柱色谱法分离原理,吸附柱色谱法是利用各组分在吸附剂与洗脱剂之间的吸附和溶解（解吸）能力的差异而达到分离的。当组分分子到达吸附剂表面时，由于吸附剂表面和组分分子的相互作用，使组分分子吸附在吸附剂表面。当洗脱剂连续通过吸附剂表面时，由于洗脱剂对组分分子的作用力，组分分子会被洗脱剂溶解下来，在一定的温度下，吸附和溶解达到平衡。但由于洗脱剂不断地移动，这种吸附和溶解过程会反复发生并建立新的平衡，组分分子就随洗脱剂移动，移动速度与组分分子的平衡常数和洗脱剂的流速有关。当流速一定时，各
18、组分就依据吸附平衡常数的不同而得到分离。,3.2 吸附色谱柱填料,在吸附色谱色谱中，为了使试样中各种在吸附能力稍有差异的组分能够分开，必须选择适当的固定相（吸附剂）和流动相（洗脱剂）。吸附剂的选择主要根据吸附剂性质和分析要求通过实验来现在。,对吸附剂的一般要求：具有较大的表面积和足够的吸附能力对不同组分有不同的吸附能力化学惰性，即不溶于流动相，不与样品组分和流动相起化 学反应 颗粒均匀，具有一定的机械强度的粒度一般采用白色或无色吸附剂，便于观察实验 常用的吸附剂硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、纤维素等。,（1）硅胶色谱硅胶是由弹性多聚硅酸脱水制成，其吸附中心是硅醇基。硅酸性能稳定，是带有微弱酸性
19、的极性吸附剂，特别是它具有很好的惰性、吸附容量大、容易制成各种不同尺寸的颗粒。硅胶可用于分离酸性和中性物质，如有机酸、氨基酸、萜类和甾体等。,（2）氧化铝色谱氧化铝由氢氧化铝在300-400时脱水制得，它吸附能力比硅胶强。氧化铝通常中性、酸性和碱性三种。在实际使用中，酸性氧化铝（pH4-5）主要用于有机酸、某些酯类、酸性多肽类、酸性色素等化合物的分离。碱性氧化铝（）主要用于碱性化合物的分离。中性氧化铝用于生物碱类、挥发油、萜类、油脂、树脂、皂甙类以及酸性、碱性氧化铝可分离的化合物。,硅胶和氧化铝的吸附活性,硅胶和氧化铝的吸附能力与其含水量有关。通过加热方式除去吸附水，可提高吸附剂的吸附活性。一
20、般通过实验测定，将硅胶和氧化铝的活性分为五级（-）。级硅胶的含水量最少，它的活性最高，对极性化合物的吸附能力最强。吸附剂活度与含水量的关系 氧化铝 硅胶 0 0 3 5 6 15 10 25 15 38,(4)聚酰胺,色谱用聚酰胺是白色多孔性的非晶形粉末，它不溶于水及甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、苯等有机溶剂；对碱比较稳定，对酸的稳定性较差。聚酰胺分子内存在很多的酰胺键，它与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键，可对这些化合物进行吸附分离。,（5）吸附剂的选择,在分离极性较强的化合物时，一般选用活性较小的吸附剂。而分离极性较弱的化合物时，就选用活性较大的吸附剂。极性吸附剂选择性地吸附不饱和的
21、、芳香族的和极性分子。非极性吸附剂如活性炭、硅藻土对极性分子无吸附能力。,3.3 吸附色谱洗脱剂,流动相的洗脱作用实质上是洗脱剂分子与样品组分竞争占据吸附剂表面活性中心的过程。为了要使试样中吸附能力稍有差异的各种组分分离，应根据试样的性质，吸附剂的活性，选择适当极性的洗脱剂。化合物极性与其结构有关。按结构的特征，各种有机物的极性大小顺序为：烷烃 烯烃 醚类 硝基化合物 酯类 酮类 醛类 胺类 醇类 酚类 酸类常用溶剂的极性大小顺序为：石油醚 环己烷 四氯化碳 苯 乙醚 乙酸乙酯 丙酮 乙醇 水,在进行吸附柱色谱分离时，应根据样品的性质、吸附剂的性能、流动相的极性三方面的影响因素加于选择。一般的
22、选择规律是：样品极性较大，在极性吸附剂柱上进行分离，则应选用吸附性较弱（即活性较低）的吸附剂，用极性较大的溶剂进行洗脱。组分的极性较弱，就应选用吸附性较强（即活性较高）的吸附剂，用极性较小的溶剂进行洗脱。,样品、吸附剂和洗脱剂的极性关系,3.4分配柱色谱分离原理,分配色谱是利用各组分在两种互不混溶溶剂间的溶解度差异来达到分离的。在分配柱色谱分离时，这两种互不混溶的溶剂之一是流动相；另一种是吸收在载体或担体中的溶剂，例如，含有一定量水分的硅胶，其所含的水分可作为固定相。当流动相带着试样中的各种组分通过色谱柱时，样品组分就在流动相和固定相之间进行多次反复分配，当不同的组分分配系数有差异时，它们以不
23、同的迁移速度通过色谱柱得以分离。,3.5 分配柱色谱的固定相和流动相,常用的载体有硅藻土型、硅胶型、纤维素和高分子聚合物型等；使用的固定相多是一些极性较强的溶剂，如水及各种水溶液，甲醇、甲酰胺等。常用的流动相溶剂有：石油醚、醇类、酮类、酯类、卤代烷烃和苯等以及它们的混合物。在实际工作中，为了防止色谱过程中流动相把吸附于载体上的少量水分带走，流动相应预先以水饱和，并应加入醋酸、氨水等弱酸、弱碱，以防止某些被分离组分离解。,3.7柱色谱实验技术,分配柱色谱法分离速度较慢，处理量小，温度的影响较大，因此能用吸附柱色谱分离的试样总是尽量采用吸附柱色谱法来解决。柱色谱实验技术包括柱子的准备、固定相和流动
24、相的选择、加样和洗脱、组分收集和鉴定等步骤。每一步操作都会给分离带来影响，因此，要使混合物得到良好分离，必须根据实验原理仔细进行操作。,1）装柱根据样品量和分析要求选择分离柱。常用直径和长度比为1:10-1:50玻璃管，下端用玻璃丝塞住或固定一砂芯板。样品量和吸附剂之比，通常为1:50-1:30。吸附剂的粒度一般为80-100目。使用前应根据需要进行活化处理。装柱方式 干法装柱：将干燥吸附剂直接装柱，适用于粗颗粒吸附剂的装填。湿法装柱：将吸附剂倒入合适的溶剂中做成匀浆装柱，适合于细颗粒吸附剂的装填。,2）加样溶解样品的溶剂极性要小，样品浓度要适当，但加样体积要尽量小，使样品带尽可能窄。3）洗脱
25、 选择合适的洗脱剂进行洗脱。在洗脱时要控制流速，对于1cm直径的玻璃柱，通常是0.5-2.0 mL/min。流速太快，分离不好；流速太慢，分离时间太长。洗脱时应注意不让洗脱剂流干，以免影响分离效果。,4）组分收集和鉴定 对于有色组分，可以直接看到各个分离后的色带；对于无色物质，可以定体积收集流出液，用薄层色谱或其它检测方法鉴定。分离后的各个组分，可分段洗脱，分别测定；也可以将整条吸附剂从柱中推出，分段切开，分别洗脱后测定。,5.4 纸色谱,纸色谱法（Paper Chromatography,PC）是一类以滤纸为载体的色谱法。它具有简单、分离效能较高、所需仪器设备价廉、应用范围广泛等特点，因而在
26、有机化学、分析化学、生物化学等方面得到应用。纸色谱实验方法,4.1纸色谱原理,滤纸由纤维素组成，通常它可以吸附20%的水，其中约6%的水是与纤维素结合成复合物，构成纸色谱的固定相。而流动相为不与水相溶的有机溶剂。这样的纸色谱法属于分配色谱。在纸色谱分离过程中，由于滤纸纤维素的毛细管现象，使溶剂在纸上渗透展开(development)，这样样品组分在两相中作反复多次分配达到分离。毛细管现象,4.2比移值 在纸色谱和薄层色谱中，样品组分在层析板上的位置（见图7.），可用比移值(retardation factor，Rf)表示：比移值的大小与该组分的分配系数大小有关，它平面色谱实验中唯一可用数值表示
27、的参数，是物质的特征值。,比移值测量,在确定的色谱条件下，Rf值应为一常数，其值在0-1之间。利用Rf值的特征性可对各组分进行定性鉴定。实际分离中，各种物质的Rf值应控制在0.05-0.85之间，两物质的Rf值差值应大于0.05才能分离。,影响Rf值的主要因素,展开剂的pH：弱酸和弱碱的离解受pH影响，离解度越大，极性越强，越易分配在极性强的一相；温度：温度变化会引起分配系数变化，也可能改变展开剂的组成；滤纸的性质：主要是厚度、均匀性、纸纤维的松紧程度以及无机离子含量的差异；展开距离：在相同的条件下，展开距离大，Rf值大；层析缸的饱和程度：未饱和时，Rf值可能增大；共存物质。,影响Rf值的主要
28、因素,由于Rf值的影响因素较复杂，要得到重现性好的Rf值，需要严格控制实验条件。为了消除系统误差，有时在实际工作中，人们采用相对比移值Rst进行定性：所采用的对照物可以是样品的一个组分，也可以是加入的外标，Rf值可大于1。,4.3 纸色谱的实验技术,1）层析滤纸的选择层析滤纸由高纯度的棉花制成，它与普通滤纸的差别在于滤纸的质量，包括杂质的含量。对滤纸总的要求是均匀、紧密、纯净。商品层析滤纸分为快速、中速、慢速；以及厚薄型等规格。中速薄型层析滤纸，如新华2#层析滤纸适合一般用途分离。滤纸的形状可以是长条、方形和圆形等。,2）点样液体样品可直接点样。固体可溶解在适当的溶剂中，一般采用与展开剂极性相
29、似的溶剂，大约配成1%的浓度。点样量与层析纸的性能、厚薄、显色剂的灵敏度以及展开方式有关，一般点样体积在0.002-0.2 mL之间或几微克到几十微克之间。点样方式可采用玻璃毛细管或微量注射器进行。点样点距滤纸一端约2-4cm为宜，两点之间的距离约1-2cm。点样时斑点一般不应大于3mm。对于稀溶液，可以在溶剂挥发后再次点样。,3）展开展开剂(development solvent)的选择，对纸色谱分离来说是起决定作用的。应根据分离对象、溶剂的性质选择展开剂。通常采用二元或三元溶剂系统，以保证样品在展开剂中有一定的溶解度和足够的分离度。如分离氨基酸可采用正丁醇-醋酸-水（12：3；5）三元展开
30、剂系统。纸色谱法展开必须在一密闭容器中进行。展开前，应先将溶剂置于容器内，使其为溶剂蒸气充分饱和。必要时，容器内壁应衬滤纸，以保持层析室的溶剂蒸气饱和。,展开方式,上行法：将滤纸上端挂起，下端浸入展开剂展开。下行法：将滤纸上端折纹浸入展开剂中，向下方展开。辐射法：展开剂由圆形滤纸中央向四周展开。双向展开法：先后用两种不同的展开剂在垂直方向展开。,4）检出（显色）纸色谱展开完毕后，应用笔画下展开剂前沿，并将滤纸风干。对无色物质需要显色确定组分斑点的位置。通常采用特定的显色剂喷湿滤纸显色。如茚三酮显色剂鉴别氨基酸；硝酸氨银显色剂鉴别糖类物质；亚铁氰化钾溶液鉴别某些金属离子等。,4.4 纸色谱法应用
31、举例,定性分析：一般采用标准物质同时展开，对照比移值。定性时要严格控制实验条件，选用不同的展开剂和展开方法，重复测定比移值。为了消除各种因素的影响，在实际工作中可采用相对比移值（Rst）定性。定量分析：纸色谱法一般只能达到半定量分析。可采用斑点目视法或斑点洗脱测量法。斑点目视法：比较样品斑点和参考物斑点的面积大小和颜色深浅，估计其含量大小。纸色谱法不仅适用于分离水溶性或极性较大的有机物的分离和检出，也可以用于分离和检出无机化合物。,氨基酸分离,氨基酸的分离一般需用双向展开。先用酚/水（7：3）展开剂做第一次展开；再用丁醇/醋酸/水（4：1：2）展开剂作第二次展开，然后用茚三酮溶液显色，可分离出
32、约20种氨基酸。,菠菜提取液的辐射纸色谱,5.5 薄层色谱,薄层色谱法（Thin layer chromatography,TLC）是在纸色谱和柱色谱发展起来的一种微量分离技术。它的操作方式类似于纸色谱。但由于它的固定相多、分离效率高、检出灵敏度高以及分离过程快等优点，应用远比纸色谱广泛。如反应终点控制、工艺条件选择、产品质量检验和未知试样剖析等，它也成为一些国家药典上的标准方法。,5.5.1 薄层色谱原理,薄层色谱法是把吸附剂均匀地涂布于玻璃板或塑料板上使之形成薄层（固定相），试液滴于薄层板的起始线上，待溶剂挥发后，放入盛有一定展开剂的展开室。由于薄层的毛细管作用，展开剂沿着薄层板不断展开，
33、样品中的各个组分就沿着薄层在固定相和流动相之间不断地发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的色谱分配过程。经过一段时间的展开，不同组分就在薄层上分开。如果试样组分有颜色，就可以看到各个色斑。否则，应进一步显色，确定各个组分在薄层中的位置。,薄层色谱的毛细管作用:由于薄层色谱的吸附剂颗粒很细，颗粒间狭窄通道类似于毛细管，因而和纸色谱一样，展开剂可以沿薄层板向上展开。与纸色谱法一样，薄层色谱的Rf值也是组分的特征值，同样受到许多实验因素的影响。在用薄层色谱进行分离鉴定时，应尽量保持操作条件一致。,薄层色谱法的特点：快速；分离效率高；灵敏度高；可用浓硫酸或高温灼烧显色；应用面广；试样量较大；斑点易拖尾，Rf
34、的重现性较差。,552 薄层色谱固定相,薄层色谱固定相大致与柱色谱固定相相同，但薄层色谱固定相颗粒更细，分离效能更高。与柱色谱不同的是，薄层色谱固定相是通过加入一定量的粘合剂或烧结方式使吸附剂牢固地吸在薄层板上而不脱落。常用的粘合剂有煅石膏、淀粉、羰甲基纤维素等。普通薄层板可以实验室涂布，但目前市场上提供各种规格的高效薄层色谱板商品。薄层色谱法中常用硅胶、氧化铝、硅藻土、纤维素和聚酰胺等吸附剂。,硅胶是一种微酸性物质，适合于酸性和中性物质的分离。常见的薄层硅胶商品有：硅胶G：加有黏合剂石膏的硅胶；硅胶H：不含粘合剂石膏的硅胶；硅胶HF：不含粘合剂而加荧光指示剂的硅胶；硅胶GF：加有黏合剂石膏和
35、荧光指示剂的硅胶；硅胶CMC：加有黏合剂羰甲基纤维素的硅胶。氧化铝是一种吸附能力强的吸附剂，适合于分离碱性、中性和极性弱的物质。,553 薄层色谱展开剂,薄层色谱所用的展开剂主要是低沸点的有机溶剂。采用吸附色谱，对极性较大的化合物进行分离应选用极性较大的展开剂，极性较小的化合物应选用极性较小的展开剂。当单一溶剂作展开剂不能很好分离时，可考虑改变展开剂的极性或选用混合溶剂展开。如果Rf值都较小，靠近原点时，可考虑增大展开剂极性或加入适量的极性较大的溶剂。如果Rf值都较大，靠近溶剂前沿时，可考虑减少展开剂极性或加入适量的极性较小的溶剂。有时二元展开剂亦不能获得满意的分离，就需要加入第三、第四种溶剂。其目的是：改变展开剂的极性；调整展开剂的酸碱性和增加溶质的溶解度。,
