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1、免疫组织化学技术,Immunohistochemistry,IHC,Immunocytochemistry,ICC,基本原理 利用免疫学中抗原与抗体特异性结合的特点以及组织化学的原理，在组织或细胞标本中加入特定的标记抗体，然后对标记物进行显示，从而对组织或细胞内的抗原物质进行定性、定位或定量研究。,免疫酶技术显示Caspase-3,免疫荧光技术显示MOR,抗原：可被T、B细胞识别，并启动特异性免疫应答的物质。即抗原可作用于T、B细胞的抗原识别受体，促使其增殖、分化，产生免疫效应物质（抗体或致敏淋巴细胞）并与之结合，从而发挥免疫效应。,抗原的两种特性：免疫原性：即能刺激机体产生免疫应答（产生特异
2、性抗体或致敏T 细胞）；抗原性：指能与其所诱生的抗体或致敏T细胞特异性结合。完全抗原：同时具备免疫原性和抗原性半抗原：只具备抗原性而不具备免疫原性,抗原决定簇或表位：决定抗原特异性的基本结构或化学基团，是免疫应答特异性的物质基础。抗原分子表面能够与抗体结合的表位数量称为抗原的价，完全抗原一般均为多价。共同抗原：两种不同的抗原分子所具有的相同或相似的抗原决定簇称为共同抗原或共同决定簇。亲缘关系很近的生物之间的共同抗原称为类属抗原；抗体对具有相同或相似决定簇的不同抗原的反应称为交叉反应。,影响免疫原性的因素：1.理化特性（大分子蛋白质可含有大量不同的抗原决定簇，是强免疫原；多糖是重要的天然抗原，如
3、细菌内毒素脂多糖、血型抗原；核酸多无免疫原性，但与蛋白结合形成核蛋白则有免疫原性；多肽类激素如胰岛素也有免疫原性）、分子量（抗原的分子量一般10kD，且分子量越大，免疫原性越强）、结构的复杂性（免疫原性物质还须具备复杂的化学组成与特殊的化学基团，如含大量芳香族氨基酸）、分子构象和抗原决定簇的易接近性等。2.宿主方面的因素：异种性（“非已”异种、同种异体、自体抗原抗原来源与宿主关系越远，免疫原性越强）、遗传因素（个体差异）、年龄、性别与健康状态。3.抗原进入机体的方式：抗原的剂量（低剂量和高剂量都不易引起免疫应答）、进入机体的途径（皮内皮下肌肉 腹腔静脉）、免疫次数（强的免疫应答需要多次注射）、
4、佐剂（可先于抗原或同时与抗原混合注射动物，以增强抗原的免疫原性，即起辅佐抗原作用的物质，如弗氏佐剂）。,抗体（antibody,Ab）机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的终末B 细胞浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。是介导体液免疫的重要效应分子。,典型的免疫球蛋白分子呈Y字型，由两条相同的重链（heavy chain,H）和两条相同的轻链（light chain,L）借二硫键连接而成。在氨基端，重链的1/4和轻链的1/2氨基酸序列变化很大，为可变区（variable region,V）；其他部分氨基酸序列相对恒定，为恒定区（constant region,C
5、）。,Fab即抗原结合片段（fragment antigen binding），由一条完整的轻链和部分重链（VH和CH1）组成。该片段具有单价抗体活性，能与一个相应的抗原决定族特异性结合。Fc即可结晶片段（fragment crystalline），Fc段含有两条重链C端的一半，包含CH2和CH3两个功能区，它无抗体活性。Ig在异种间免疫所具有的抗原性主要存在于Fc段，同时Fc段还具有活化补体、亲细胞、通过胎盘和介导与细菌蛋白结合等生物学活性。,用木瓜蛋白酶水解IgG分子，可将其裂解为两个完全相同的Fab和一个Fc片段。,多克隆抗体（polyclonal antibody,PcAb）大多数天然
6、抗原物质(如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等)往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体产生一种特异性抗体。多克隆抗体是多个抗原决定簇刺激机体后，由多个免疫淋巴细胞分泌的多种抗体的混合物。PcAb 特异性差，易出现交叉反应。,由单一克隆B细胞杂交骨髓瘤细胞产生的，只识别一种抗原表位的具有高度特异性的抗体。优点：结构均一、纯度高、特异性强、效价高、易大量制备。,制备单一表位特异性抗体的理想方法是获得针对单一表位的浆细胞克隆，使其在体外扩增并分泌抗体。但浆细胞在体外的寿命较短，也难以培养。于是，将可产生特异性抗体但短寿的浆细胞与无抗原特异性但长寿的恶性浆细胞瘤细胞融合，建立了可产
7、生单克隆抗体的杂交瘤细胞和单克隆抗体技术。,单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）,免疫组织化学方法,荧光标记免疫组织化学,酶联免疫组织化学,直接法：用酶或其他标记物标记的特异性抗体直接与标本中的相应抗原结合，再与酶的底物作用产生有色产物，沉积在抗原抗体反应的部位，即可对抗原进行定性、定位以至定量研究。,Tissue Antigen,Labeled Antibody,间接法：第一抗体不标记，使用与第一抗体种属相同的抗体Fc段（有种属特异性）作为抗原免疫动物，制备抗抗体，即第二抗体，并标记第二抗体。,Tissue Antigen,Primary Antibody,Seco
8、ndary Antibody,酶联免疫组织化学,ABC法 S-P法,亲合素生物素过氧化物酶复合物法（avidin-biotin-peroxidase complex method,ABC法）,1.生物素与亲合素有很高的亲和力2.一个亲合素分子上有四个生物素结合位点3.将亲合素作为“桥”将生物素化的抗体与生物素结合的酶连接起来，使抗原与抗体反应信号放大，以增强敏感性,链霉亲合素生物素过氧化物酶复合物法（streptavidin-biotin-peroxidase complex method,SABC法）,此法为上述ABC法的改良，是用链霉亲合素（streptavidin）代替ABC法中的亲合素
9、（avidin）,Streptavidin链霉亲合素,avidin亲合素,链霉亲合素为蛋白质，非糖蛋白，不与其它分子结合，可降低背景。,亲合素是糖蛋白，含有约7%的糖类，可与组织中含糖基的物质起反应，造成背景着色。,链霉亲合素-过氧化物酶法（streptavidin peroxidase，S-P法）,Streptavidin链霉亲合素,酶标链霉亲合素,链霉亲合素对组织的穿透性强，反应速度快；链霉亲合素的等电点接近中性（5.56.7,而亲合素为10左右），所带负电荷少，不容易与组织中的正电荷发生相互吸引，因此可降低背景着色；S-P法的放大系统不含生物素，可免除内源性生物素所造成的背景着色。,免疫
10、组织化学酶类标记物,满足条件：酶催化底物必须是特异的，并容易被显示（产物易于镜下观察）；酶反应形成的终产物必须是稳定的沉淀，不能从酶活性部位向周围组织弥散；容易获取（纯）；中性pH值时，具有稳定性；酶标记至抗体上不影响酶和抗体的活性。,常用酶类标记物,辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）H2O2和DAB（diaminobenzidine,二氨基联苯胺）为其常用底物，产物为稳定的棕黄色沉淀,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AP）：BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate，5-溴-4-氯-3-吲哚-磷
11、酸盐)和 NBT（Nitro-Blue-Tetrazolium，四唑氮蓝）是AP的常用底物组合，其中，NBT作为氧化剂,BCIP作为AP底物。,BCIP,BCIP被AP水解成一种蓝色的中间物，后者然后被NBT氧化形成二聚体（不溶性紫蓝色沉淀）。,Double staining using DAB and BCIP/NBT,免疫组织化学技术的基本要求,1、有高度特异性；2、有高度敏感性；3、不引起受检物质的移位和丢失；4、不影响抗原和抗体的免疫活性；5、不损伤组织和细胞的本来结构；6、免疫结合物借标记物明显可见,免疫组织化学标本的制备,一、组织的固定 1、目的：固定抗原的定位 保存组织细胞的形态
12、结构 2、常用固定剂和固定液：甲醛、多聚甲醛、戊二醛等 3、作用和缺点：固定组织和保存抗原 抗原易被掩盖,二、固定的方法,（一）方法：推注，滴注（二）滴注步骤：1、开胸 2、暴露心脏 3、自心尖剪开左心室 4、插入灌流针至主动脉弓 5、固定灌流针 6、快速注入冲洗液（有时可免）7、先快后慢注入固定液 8、慢注毕，将动物装入含 有少量固定液的塑料袋 置4C冰箱内静置2h后取材,三、组织包埋和切片,（一）石蜡包埋切片（二）恒冷箱切片,（一）石蜡包埋切片（二）恒冷箱切片：防冰晶 1、骤冻 2、1030%蔗糖溶液,异戊烷,干冰,组织块,冰冻切片包埋模具配套包埋剂使用,免疫组织化学染色程序,以ABC法为
13、例,组织抗原,生物素化二抗,ABC,一抗,染色程序:组织采用石蜡切片或恒冷箱切片,片厚510 m或者10 15 m。若石蜡切片则脱蜡到水 1、PBS漂洗,10 min；,染色程序:2、10%NSS（或者3%BSA）,30 min；3、1%Triton X-100,3%H2O2处理，30 min;4、兔抗血清孵育过夜；4、PBS漂洗,35 min；5、生物素化羊抗兔IgG 孵育,60 min；6、PBS漂洗，35 min；,载玻片,标签,组织切片,生物素化二抗,生物素,染色程序:7、ABC复合物孵育,60 min；8、PBS漂洗,35 min；9、DABH2O2显色液显 色，至深棕色为止，约51
14、0 min；（DABH2O2 临用前配制）,ABC,标签,组织切片,ABC,染色程序:10、先后经自来水冲洗 和双蒸水浸洗；11、常规脱水、透明、树胶封片。,染色结果：镜下观察。阴性对照试验：1、常用空白试验：即用稀释一抗的稀释液，如10%NSS等，或 PBS替代一抗，反应应呈阴性；,2、替代试验：正常兔血清或 正常羊血清代替兔抗血清或羊抗兔IgG，反应应呈阴性；3、吸附试验：一抗血清经相 应抗原预吸附处理后孵育组织切片，反应应呈阴性。,切 片,载玻片的清洁：切片粘合剂的使用：（1）多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度涂片。（2）APES 干净载玻片丙酮5min 用镊子夹住浸入APES
15、试剂（1ml+50ml丙酮）13次纯丙酮洗二次干燥玻片(37过夜)用铝箔包好，室温或4保存备用。（3）铬矾明胶液：铬矾0.5g 明胶5g H2O 1000ml,细胞爬片制作,将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内。待细胞生长达到60以上后取出玻片。用4%的多聚甲醛固定2h以上。可加甘油封存置于零下20度保存。,细胞涂片制作,离心将细胞收集出来，用预冷的PBS洗23遍，最后用PBS将细胞重悬。吸取3050ul（可根据细胞量调整）滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。待稍微风干以后加4多聚甲醛溶液覆盖细胞，固定24小时。在细胞上加一层甘油放-20保存。,细胞离心涂片机是利用液动与气动原理,
16、将收集的细胞样本进行了细胞分散,过滤从其混悬液中分离出来,均匀的喷涂在玻片上。,抗原修复,免疫组织化学方法成功与否关键在于抗原决定簇的保存和暴露。组织经甲醛固定，甲醛的醛基与抗原蛋白的氨基交联，使抗原决定簇被掩盖，从而影响对蛋白表达的检测。要充分暴露抗原决定簇，通常用到抗原修复。,加热抗原修复法 酶消化法,高压加热修复法 切片脱蜡至水;0.3%H2O2甲醇处理切片10min;蒸馏水洗;切片放入0.01M 柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）中，连同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续14min;待修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。,电炉加热修复法
17、 切片脱蜡至水;0.3%H2O2甲醇处理切片10min;蒸馏水洗;将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度，当达92后，即可拔离电源，当温度低于92时，再插上电源，如此反复持续至10min左右;待抗原修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选定的免疫组化染色方法进行染色。,Steaming temperature between 95 C-98 C which is optimal for most of antigens.set the Timer for 40 minutes that is sufficient for retrieving most antigens(so
18、me antigens need longer steaming time so optimal steaming time should be determined by user).,IHC-TekTM Epitope Retrieval Steamer Set,微波修复法 切片脱蜡至水;0.3%H2O2甲醇处理10min;蒸馏水洗;0.01M柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），于微波炉内微波辐射10min;待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。,Heat-induced Epitope Retrieval(HIER)HIER is believed to
19、reverse some cross-links and allows for restoration of secondary or tertiary structure of the epitope.The protocol must be optimized for each tissue,fixation method,and antigen to be studied.In general,HIER has a much higher success rate than PIER.HIER is performed using microwave ovens,pressure coo
20、kers,vegetable steamers,autoclaves,or water baths.Microwaves are an increasingly popular appliance for HIER.These protocols tend to involve 5 minute periods of heat followed by replacement of the buffer.For all HIER methods,slides must be cooled before commencing IHC/ICC incubations.HIER is especial
21、ly time-,temperature-,buffer-,and pH-sensitive,and the best method must be determined empirically.,R&D Systems offers reagents to improve tissue antigen detection and enhance immunoreactivity.During initial optimization,investigators can compare samples treated with neutral pH 7.0 Universal Antigen
22、Retrieval Solution(Catalog#CTS015)with a slide of the same tissue without antigen retrieval.Subsequent tests using acidic or basic antigen retrieval solutions may be necessary depending on the tissue.At R&D Systems,we find that treatment with Basic Antigen Retrieval reagent(pH 9.5,Catalog#CTS013)is
23、frequently successful.We also offer Acidic(pH 5.0,Catalog#CTS014)and Sampler(Catalog#CTS016)Antigen Retrieval Reagents.Acidic and basic antigen retrieval solutions are more likely to affect tissue morphology than a neutral solution.,The time,temperature,and pH must also be optimized for each applian
24、ce(i.e.5-10 minutes at 92-95 C in a water bath,versus 1-5 minutes at 120 C in a pressure cooker).,胃蛋白酶消化法 切片脱蜡至水;0.3%H2O2甲醇处理切片10min;蒸馏水洗;PBS洗3次;滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，处理切片20min左右;PBS冲洗3次;按选择好的免疫组化该法进行染色。,Protease-induced Epitope Retrieval(PIER)In the PIER method,enzymes including Proteinase K,Trypsin,and P
25、epsin have been used successfully to restore the binding of an antibody to its epitope.The mechanism of action is thought to be the cleavage of peptides that may be masking the epitope.The disadvantages of PIER are the low success rate for restoring immunoreactivity and the potential for destroying
26、both tissue morphology and the antigen of interest.,胰蛋白酶消化法 切片脱蜡至水;0.3%H2O2甲醇处理切片10min;蒸馏水洗;PBS洗3次;滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片20min左右;PBS洗3次;按选好的免疫组化染色方法进行染色。,注意事项,一、抗体的保存 浓缩抗体：有效期内，只需放在 4冰箱内，保存时间可达1-3年。即用型抗体：理论上在4冰箱内 可保存半年左右。PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般 只可放置1-2个月。,二、出现假阳性的原因 组织切片质量不佳，造成假象，如 刀痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作 为判断阳性的依据
27、。出血和坏死：红细胞的内源性过氧 化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化 物酶均可出现假阳性反应。抗体的交叉反应。,三、出现假阴性的原因 固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，无法补救。固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用10%中性福尔马林。抗体浓度过低。孵育时间太短，或孵育温度太低。缓冲液pH值不正确。,四、必须严格设置阳性对照和阴性对照。五、DAB有致癌性，用后不应随处倒弃。,1.Antigen retrieval Proteolytic enzyme method and Heat-induced method2.Inhibition of endogenous tiss
28、ue components 3%H2O2,0.01%avidin3.Blocking of nonspecific sites 10%normal serum,pretreatment,Positive Control It is to test for a protocol or procedure used.It will be ideal to use the tissue of known positive as a control.Negative Control It is to test for the specificity of the antibody involved.,
29、Controls,Example,1.Prepare and fix tissue 2.Antigen retrieval 3.Suppress endogenous peroxidase activity 4.Block nonspecific sites in the tissues5.Incubate the tissues with the primary antibody 6.Incubate the tissues with the secondary antibody 7.Incubate the tissues with SP8.Add DAB and incubate unt
30、il desired staining is achieved,Troubleshooting,1.Weak or No Staining 2.Over-staining 3.High Background,Weak or No Staining,Weak or No Staining,Over-staining,High Background,免疫荧光组织化学技术,将荧光作为标记物的免疫组织化学技术,荧光（fluorescence）,当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且
31、一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。,光的吸收具有高度选择性，一定能量的光量子辐射，只能被一定结构的物质分子或原子所吸收。利用该特性，制作滤光片吸收一定波长范围的光而允许特定波长的光通过，用来激发不同的荧光素，产生不同颜色的荧光。,激发光,发射光,许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光素。只有那些能够吸收特定波长的光并能在较短时间内产生明显的荧光，而且能作为染料的化合物才能用于免疫荧光技术。,FITC,TRITC,一、直接法（一）抗原直接定位法,组织中的抗原,一、直接法（二）抗体直接定位法,荧光标记的抗原,组织中的抗体,二、间接法（一）抗原间接定位
32、法,荧光标记的第二抗体（二抗）,组织中的抗原,第一抗体（一抗）,二、间接法（二）抗体间接定位法,荧光标记抗体,组织中的抗体,抗原,三、免疫荧光双标记法,（一）直接法,（二）间接法,免疫荧光双标记法的应用：1.将两种抗体分别用不同的荧光素加以标记，用来显示含有不同成分的两种细胞在同一区域的定位模式,激光扫描共聚焦显微镜观察,免疫荧光双标记法的应用：2.将两种抗体分别用不同的荧光素加以标记，用来定位同一细胞内存在的两种不同成分,荧光显微镜,在照明系统的光源中使用高压汞灯提供全波段激发光,为延长汞灯寿命，打开后不可立即关闭（至少15min），以免水银蒸发不完全而损坏电极；汞灯关闭后则不可马上打开（至
33、少30min），否则灯内汞蒸汽尚未恢复液态，内阻极小，再次施加电压会引起短路，导致汞灯爆炸。,激光共聚焦显微镜,用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。分辨率，是普通光学显微镜的3倍。用于观察细胞形态、细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。,间接法双重标记技术的注意事项,如果两种一抗来源于不同免疫动物，如兔抗和鼠抗，两种二抗必须相应为抗兔和抗鼠IgG，以免发生交叉反应。即先将两种一抗按各自工作浓度混合稀释后孵育组织切片，然后将两种二抗按各自工作浓度混合稀释后孵育组织切片。如果两种一抗来源相同，则要分开进行，即先做识别第一种抗原的反应，然后进行第二种抗原抗体反应。当两种抗原存在于同一部位而其中之一浓度较高，占绝对优势时，将妨碍另一种抗原染色，此时应先染含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原。两种一抗如果定位在细胞的同一部位（如胞核、胞浆和胞膜），最好选择荧光双标，而不选择免疫酶标双重染色。,图像分析软件,灰度：指图像每一像素的明暗（深浅）程度，即该像素的图像由黑到白变化的量化等级。灰度值的大小与物质含量多少成反比关系，灰度值越小，表示染色越深。光密度：指光线通过某一物质前与通过后光强度比值的对数值。光密度值与物质含量成正比关系。,
