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1、,病毒和朊病毒,褚建君上海交通大学生命科学与技术学院,生物学导论I：分子、细胞与生物的发育,一、病毒的发现和研究历史,1886年，A.Mayer 发现具有传染性的烟草花叶病；,1892年，D.Ivanovsky:烟草花叶病病原体能通过细菌滤器：一种能通过细菌滤器的”细菌毒素”或极小的细菌,1898年，M W Beijerinck对烟草花叶病病原体的研究结果：,能通过细菌滤器；可被乙醇沉淀而不失去其感染性，能在琼脂凝胶中扩散；用培养细菌的方法不能被培养出来，推测只能在植物活细胞中生活；,比细菌小的具有传染性的活的流质（contagium vivum fluidum）,1900年前后，包括口蹄疫（
2、foot and mouth disease）在内的多种动植物疾病病原体的滤过性特性被证明。,filterable viruses（滤过性病毒）,viruses（病毒）,1935年，W M Stanley首次提纯并结晶了烟草花叶病毒；Bawden等证明烟草花叶病毒的本质为核蛋白；1940年，Kausche首先用电镜观察到烟草花叶病毒颗粒；,禽流感病毒正在侵染细胞（2007年）,病毒学（Virology）：研究病毒（virus）的本质及其与宿主的相互作用的科学。,例如一些简单的病毒仅由核酸和蛋白质外壳（coat）构成，故可把它们视为核蛋白分子。,二、病毒的特点和定义,特点,1）不具有细胞结构，具
3、有一般化学大分子的特征。,2）一种病毒的毒粒内只含有一种核酸，DNA或者RNA。,3）没有催化能量代谢的酶或酶系极不完全，不能进行独立的代谢作用。,4）严格的活细胞内寄生，必须依赖宿主细胞进行自身的核酸复制，形成子代。,5）个体微小，在电子显微镜下才能看见。,6）对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感。,单细胞微生物与病毒性质的比较,a DNA病毒和RNA病毒中的一部分;b 利福平可抑制痘病毒复制,病毒的个体特点,形体极其微小，必须在电子显微镜下才能观察，一般都可通过细菌滤器；无细胞构造；主要成分仅为核酸和蛋白质；每一种病毒只含一种核酸，DNA或RNA；无产能酶系，也无蛋白质合成系统；不存在个体的
4、生长；细胞内专性寄生；在离体条件下，以无生命的大分子存在。,病毒的定义,迄今仍无一个科学而严谨的定义,病毒为具有独立于其宿主进化史的绝对细胞内寄生物，它的DNA或RNA基因组被其所编码的蛋白质壳体化（encapsidation）。-（Fields等，1990年）,非细胞生物,（真）病毒：至少含核酸和蛋白质二种组分,亚病毒,类病毒：只含具侵染性的RNA组分卫星RNA：只含有不具侵染性的RNA组分,朊病毒（普列昂）：只含蛋白质,三、病毒的宿主范围及其多样性,病毒几乎可以感染所有的细胞生物，并具有宿主特异性,噬菌体（phage）植物病毒（plant viruses）动物病毒（animal virus
5、es）,-形态：最小：细小病毒（20nm）最大：痘病毒（300nm）最长：线状病毒（800-900nm,最长：14000nm）核酸类型：DNA/RNA；单链/双链/部分单链；线状/环状。,病毒的多样性,四、病毒的培养和纯化,1、病毒的培养,噬菌体,细菌培养物,培养液,营养琼脂平板,细菌培养液变清亮,细菌平板成为残迹平板,二元培养物法,噬菌体经过适当稀释再接种细菌平板，培养后在菌苔上可形成圆形局部透明区域，即噬菌斑(plague)如同对细菌计数一样，形成的噬菌斑也可用于对噬菌体的数目进行估算。,动物病毒的培养：,1、实验动物,2、鸡胚,3、多种细胞培养,免疫缺陷动物(SCID 小鼠）对病毒感染无
6、免疫排斥可接入人的免疫细胞等，使之具有人的免疫功能，用于研究HIV、疱疹病毒等与免疫系统的相互关系,SCID：severe combined immunodeficient,鸡胚的构造和病毒培养,羊膜腔,尿囊腔,卵黄囊,尿囊绒膜,单纯疱疹病毒,痘病毒,劳氏肉瘤病毒,流感病毒,腮腺炎病毒,单纯疱疹病毒,流感病毒,腮腺炎病毒,新城疫病毒,鸟类腺病毒,1、病毒的培养,若标本经过适当稀释进行接种并辅以染色处理，病毒可在培养的细胞单层上形成肉眼可见的局部病损区域，即蚀斑（plaque）或称空斑。,大多数动物病毒感染敏感细胞培养层能引起其显微表现的改变，即致细胞病变效应（cytopathic effect
7、,CPE），例如细胞聚集成团、肿大、圆缩、脱落，细胞融合形成多核细胞，细胞内出现包涵体（inclusion body），乃至细胞裂解等。,细胞培养层,植物病毒的培养,植物病毒,敏感植物叶片,产生坏死斑，或称枯斑,蛋白质提纯方法（盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、凝胶层析、离子交换等）,2、病毒纯化,标准,纯化的病毒应保持感染性,病毒是有感染性的生物体,病毒具有化学大分子的属性,纯化的病毒应具有理化性质均一性,方法,主要化学组成为蛋白质,具有一定的大小、形状和密度,差速离心,梯度离心（超速离心）,四、毒粒的性质,毒粒（病毒颗粒）：病毒的细胞外颗粒形式，也是病毒的感染性形式。,一团能够自主复制的遗传
8、物质,蛋白质外壳,包膜,1、毒粒的形态,病毒的大小和形状,个体小，必需在电镜下观察；,不同病毒的毒粒大小差别很大；,形状：球形（或称拟球形颗粒）杆状 等少数几类。复杂形状（如蝌蚪状，卵形）,采用各种电镜技术观察毒粒的形态结构,Orf virus：口疮病毒(接触性脓疱皮炎病毒)（负染技术）,Ebola virus：埃博拉病毒（正染技术）,Vaccinia virus 痘病毒（投影技术）,2、毒粒的壳体结构,壳体或衣壳（capsid）：,包围着病毒核酸的蛋白质外壳,壳体结构类型,螺旋对称二十面体对称双对称,螺旋对称壳体：亚基有规律地沿着中心轴（核酸）呈螺旋排列，进而形成高度有序、对称的稳定结构。,
9、例：烟草花叶病毒,二十面体对称壳体：蛋白质亚基围绕具立方对称的正多面体的角或边排列，进而形成一个封闭的蛋白质的鞘。,若以一定数目的亚基排列成具有一定表面积的立方对称实体，以二十面体容积为最大，能包装更多的病毒核酸，所以病毒壳体多取二十面体对称（icosahedral symmetry）结构。,具有双对称结构的典型例子是有尾噬菌体（tailed phage）,其壳体由头部和尾部组成。包装有病毒核酸的头部通常呈二十面体对称，尾部呈螺旋对称。,双对称结构/复杂对称：,3、病毒的包膜结构,蛋白质壳体+核酸（核心），又称核衣壳。,核壳体（nucleocapsid）：,裸露毒粒（naked virion）
10、：仅由核衣壳构成的病毒颗粒,包膜（envelope）：,核衣壳外的一层脂蛋白膜，由宿主细胞膜衍生而来作用：保护病毒核壳；启动病毒感染；,病毒包膜的基本结构与生物膜相似，是脂双层膜。在包膜形成时，细胞膜蛋白被病毒的包膜糖蛋白取代。刺突（spike）：包膜或核衣壳上的突起。,有包膜的二十面体毒粒；,裸露的二十面体毒粒,有包膜的螺旋毒粒,裸露的螺旋毒粒；,复杂对称的病毒,Vaccinia virus 痘病毒在病毒中体积最大，在光学显微镜下勉强可见。,有尾噬菌体,ii.,病毒粒子的基本形态球状、杆状和复合状的无包膜病毒,烟草花叶病毒,P2噬菌体,T2噬菌体,脊髓灰质炎病毒,病毒粒子的基本形态包膜病毒,
11、疱疹病毒,流感病毒,腺病毒,HIV病毒人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus），它会造成人类免疫系统的缺陷。1981年，此病毒在美国首次发现。它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒（Lentivirus），属反转录病毒的一种。至今无有效疗法的致命性传染病。该病毒破坏人体的免疫能力，导致免疫系统的失去抵抗力，从而导致各种疾病及癌症得以在人体内生存，发展到最后，导致艾滋病（获得性免疫缺陷综合征）。,2008年诺贝尔奖,德国科学家哈拉尔德楚尔豪森因发现人乳突淋瘤病毒引发子宫颈癌获此殊荣；两名法国科学家弗朗索瓦丝巴尔西诺西和吕克蒙塔尼因发现人类免疫缺陷病毒获此殊荣。,
12、SARS病毒为冠状病毒,五、毒粒的化学组成,1、病毒的核酸,核酸是病毒的遗传物质；一种病毒的毒粒只含有一种核酸：DNA或是RNA；,病毒核酸,单链DNA（ss DNA）；双链DNA（ds DNA）；单链RNA（ss RNA）；双链RNA（ds RNA）；,2、病毒的蛋白质,病毒蛋白质,结构蛋白,非结构蛋白,病毒基因组编码的，在病毒复制过程中产生并具有一定功能，但并不结合于毒粒中的蛋白质。,构成一个形态成熟的有感染性的病毒颗粒所必需的蛋白质。,壳体蛋白；包膜蛋白；存在于毒粒中的酶；,参与病毒的入侵或复制（如逆转录酶等）；,保护作用启动感染（决定感染的特异性）,六、病毒的复制,病毒感染敏感宿主细胞
13、后，病毒核酸进入细胞，通过其复制与表达产生子代病毒基因组和新的蛋白质，然后由这些新合成的病毒组分装配（assembly）成子代毒粒，并以一定方式释放到细胞外。病毒的这种特殊繁殖方式称做复制（replication）。,1）感染宿主细胞；2）病毒核酸复制与表达；3）产生子代病毒基因组和新的蛋白质；4）组分装配（assembly）成子代毒粒；5）释放到细胞外；6）重复上述过程；,病毒的复制过程（复制周期）,2、病毒感染的起始,1）吸附：,毒粒,敏感细胞,随机碰撞而接触（静电引力或氢键）,可逆吸附，无特异性（非细胞颗粒也可吸附）,病毒表面蛋白与细胞受体的结合,特异性，不可逆吸附，启动病毒感染的第一阶
14、段,吸附于大肠杆菌上的噬菌体,2）侵入：,侵入又称病毒内化，一个病毒吸附后几乎立即发生，是一个依赖于能量的感染步骤。不同的病毒-宿主系统的病毒侵入机制不同,有尾噬菌体的侵入方式：注射方式将噬菌体核酸注入细胞,动物病毒的侵入方式：,植物病毒的侵入方式：,通过机械损伤所形成的微伤口进入细胞；或者靠携带有病毒的媒介，主要靠是有吮吸式口器的昆虫取食将病毒带入细胞。,植物病毒一旦进入细胞后，增殖产生的子代病毒或病毒核酸可通过病毒编码的运动蛋白（movement protein）与胞间连丝的相互作用从受染细胞进入邻近细胞。,3）脱壳：,脱壳是病毒侵入后，病毒的包膜和/或壳体除去而放出病毒核酸的过程。,T-
15、偶数噬菌体脱壳与侵入是一起发生的,动物病毒存在不同的结构类型和不同的侵入方式，其脱壳过程也较复杂。,病毒的毒粒消失，失去原有的感染性，进入潜隐期。,3、病毒大分子的合成,病毒基因组进入胞内,病毒利用宿主的生物合成能力，使病毒核酸表达和复制，产生大量的病毒蛋白质和核酸。,病毒生物合成的第一步是病毒mRNA的合成,dsDNA virus(class I):与寄主基因组相同的方式产生mRNA和复制DNA。,ssDNA virus(class II):先合成一条双链DNA，这条双链DNA指导DNA复制与mRNA合成。,ssRNA(+)virus(class IV):可直接作为mRNA使用。,ssRNA
16、(-)virus(class V):以此为模板合成mRNA,反转录病毒(class VI):属RNA病毒，通过反转录产生双链DNA中间媒介，再以此指导mRNA与病毒基因组的合成,dsRNA virus(class III):以其中一条链为模板合成mRNA,Viruses in Class VII(ds DNA)通过一条RNA中间体来合成DNA，需要反转录酶。但与I类病毒以相同方式产生mRNA.,病毒生物合成的第一步是病毒mRNA的合成,特异性酶蛋白及蛋白质外壳的合成,4、病毒的装配与释放,新合成的毒粒结构组分组装成完整的病毒颗粒，称做病毒的装配，亦称成熟（maturation）或形态发生（mo
17、rphogenesis）。,成熟的子代病毒颗粒依一定途径释放到细胞外,病毒的释放标志病毒复制周期结束,七、朊病毒 Prions,蛋白质感染性因子，其胞外形式只含有蛋白质而无核酸（可以引起同种或异种蛋白质构象改变而致病或功能改变）。可引起动物脑部疾病bovine spongiform encephalopathy(mad cow desease)牛海绵状脑病(疯牛病)Human KuruHuman Cretzfeldt-Jakob Disease(CJD),人的库鲁病(kuru)、克雅氏病(Creutzfeldt Jakob disease,CJD)等,羊搔痒症(scrapie),牛海绵状脑病(
18、spongiform encephalopathy),疯牛病,最先在澳大利亚的殖民国新几内亚发现的，开始是人有此症状，后来发现此病与牛有关，经研究病因是牛海绵状脑病的发作，病程一般为14天至6个月，其神经症状可分为三个类型。：1.最常见的是精神状态的改变，如恐惧、暴怒和神经质。2.3的病例出现姿势和运动异常，通常为后肢共济失调、颤抖和倒下。3.90的病例有感觉异常，表现多样，但最明显的是触觉和听觉减退。大部分患牛（87）出现的临诊症状可分为以上三种。这与中枢神经系统的弥漫性病变相一致。,朊病毒致病机理,Neuronal cells produce normal prion protein(Pr
19、Pc)in cell.Abnormally folded prion protein(PrPsc)can catalyze refolding of PrPc to PrPsc.PrPsc is protease resistant,insoluble,and forms aggregates in neural cells.This eventually leads to destruction of neural tissues and neurological symptoms.,其致病作用是由于动物体内正常的蛋白质PrP c改变折叠状态为PrP sc所致，而这二种蛋白质的一级结构并没有
20、改变。,Prusiner(1982)提出羊搔痒病因子是一种蛋白质侵染颗粒（proteinaceous infectious particle），并将之称做Prion或Virino。朊病毒,1997年，Stanley B.Prusiner荣获诺贝尔奖,朊病毒不仅与人类健康、家畜饲养关系密切，而且可为研究与痴呆有关的其他疾病提供重要信息。就生物理论而言，朊病毒的复制并非以核酸为模板，而是以蛋白质为模板，这必将对探索生命的起源与生命现象的本质产生重大的影响。,研究朊病毒的意义,八、类病毒和卫星病毒,类病毒是一类小分子的环状单链RNA分子大小：246 to 399 b.己发现的病毒具有高度的同源性（可
21、能有相同的进化起源）胞外形式：裸露的RNA，无蛋白衣壳，RNA中也无编码蛋白质的基因,Structure of viroids.Single-stranded circular RNA can form a seemingly double-stranded structure by intrastrand base-pairing.,类病毒通过伤口进入植物细胞，通过一种植物RNA聚合酶而在寄主细胞核内复制。,受染植物可能没有任何症状，也可能出现中度至致死性症状（取决于不同类病毒）,卫星病毒,卫星病毒：依赖于辅助病毒提供复制酶进行复制，并且都编码有壳体蛋白。形态结构和抗原性不同于辅助病毒，基因组与辅助病毒也少有同源性对辅助病毒的依赖性相当专一。卫星RNA：指一些必须依赖辅助病毒进行复制的小分子单链RNA片段，它们被包装在辅助病毒的壳体中。本身对辅助病毒不是必需的，且与辅助病毒的基因组无明显同源性。许多卫星RNA能显著影响其辅助病毒在宿主中所产生的症状。,思考题：,什么是病毒粒子（毒粒）？其化学组成如何？病毒的壳体有哪些结构类型？分别有何特点？病毒蛋白质有哪些类型和特点？什么是病毒的复制周期？病毒的复制周期有哪些过程？在病毒的侵入过程中，噬菌体植物病毒动物病毒各有何不同？,
