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1、肿瘤的基因诊断,温州医学院检验医学院温州医学院附一医检验科陶 志 华,肿瘤是细胞的异常增生 有结构、功能和代谢的异常 具有超过正常细胞增生能力,肿瘤概念,在细胞内核酸代谢的异常:肿瘤细胞和正常细胞的核酸代谢有显著的不同；不同类型肿瘤细胞的核酸代谢也有较大的差异；相同恶性程度肿瘤细胞的核酸代谢也有所不同。,肿瘤是一种分子病,癌基因的激活 抑癌基因的失活（或缺失）,肿瘤发生机理,原癌基因癌基因病毒癌基因 肿瘤抑制基因 肿瘤转移相关基因 肿瘤耐药基因等,肿瘤相关基因,细胞基因组中具有能够使正常细胞发生恶性转化的基因 癌基因在正常细胞的基因组中 存在 不表达状态 表达水平不足以引起细胞的恶性转化,癌基
2、因：,表1细胞癌基因按其产物定位和功能分类,能够抑制细胞恶性转化或抑制细胞异常 增殖的基因 目前研究较多的有p53基因、pRB基因、p16蛋白、p15蛋白、p21等。,抑癌基因,表2 已确定的几种抑癌基因,野生型P53生物学活性,当DNA损伤的时候,P53基因就明显表达使细胞在G1期生长阻滞，促使细胞凋亡。抑制肿瘤细胞生长保持DNA完整性,包括肿瘤转移促进基因或肿瘤转移抑制 基因。,肿瘤转移相关基因,其表达使肿瘤细胞对药物产生耐药的基因。,肿瘤耐药基因,血小板衍生生长因子（PDGF）表皮生长因子（EGF）VGF基因等,肿瘤生长因子,肿瘤的基因诊断,肿瘤的基因诊断目前主要集中在以下几个方面：肿瘤
3、转移标志物肿瘤抗药基因突变的癌基因肿瘤相关的病毒基因,表3 肿瘤基因诊断的分子标志及其应用,可分为四大类 组织特异性基因标志 肿瘤特异性基因标志 血管生成因子 其它与肿瘤转移相关的分子及基质蛋白酶及其抑制剂,肿瘤转移基因标志物,组织特异性基因标志物,指肿瘤组织和/或起源正常组织所特有，在淋巴组织和血细胞中不存在的。如角质蛋白家族（CK）mRNA、粘蛋白基因、表皮生长因子受体（EGFR）mRNA等。.,肿瘤特异性基因标志物,存在于肿瘤及其起源的正常细胞中，不存在于其他细胞。如CEA mRNA、AFP mRNA、PSA mRNA等。,血管生成因子,如血管内皮细胞生长因子（VEGF）等。,肿瘤抗药基
4、因,对于肿瘤化疗效果及预后进行推测；还可以将肿瘤抗药基因导人骨髓细胞，特别是骨髓干细胞中，提高机体对于抗肿瘤化疗药物的耐受程度，如此可以加大抗肿瘤化疗药物的使用剂量，提高抗肿瘤化疗的治疗效果。,肿瘤抗药基因,多药抗性基因一l（MDR1），其编码的蛋白如P-糖蛋白起排流泵作用。.其它一些与细胞内药物代谢有关的基因也可以看作是肿瘤抗药基因，如谷胱苷肽S一转移酶（GST），可使机体解毒功能增强；癌基因 bcl-2的表达可抑制肿瘤化疗药物所诱导的肿瘤细胞程序化死亡等。.,突变的癌基因,癌基因的突变是癌基因激活的重要方式和途径。除了见到较大范围片段的缺失或插人以及染色体转位之外，大多数情况下，都是少数核
5、苷酸或单个碱基的突变。.癌基因点突变的检测 单链构象多态性（SSCP）检测技术等.,肿瘤相关的病毒基因,EB病毒（EBV）人乳头瘤病毒（HPV）乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）感染,对于这些肿瘤组织细胞中相关病毒基因及其编 码产物的检测，可以作为这些类型的肿瘤诊断的标志。,致瘤病毒引起的恶性转化作用引起了人们极大的关注,肿瘤基因诊断的常用方法,PCR、RT-PCRSouthern blot杂交技术、Northern blot杂交技术基因芯片基因测序。,肿瘤基因的分子诊断意义,1.肿瘤的早期诊断和筛选2.肿瘤疗效监测 3.肿瘤的预后判断 4.肿瘤微转移检测,肿瘤基因检测在肿瘤微转移
6、检测中应用举例,前列腺癌特异性基因DD3PCA3,DD3PCA3是一种非编码RNA的基因，定位于9q2122染色体。它为前列腺癌特异性基因之一，DD3PCA3 mRNA仅在前列腺癌细胞中表达，而在其它正常组织和癌组织以及细胞系中均不表达。,DD3 mRNA 14外显子扩增结果,M：50bp DNA Ladder；1：LNCaP阳性对照；2 3：PCa；4：PIN；5 6：BPH；7：直肠癌；8：直肠癌癌旁；9：结肠癌；10：结肠癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲状腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：软组织纤维肉瘤；17：转移性腺癌；18：淋巴结转移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎
7、瘤；20：正常肝脏；21：胆囊；22：胎盘；23：试剂空白。,DD3 mRNA 13外显子扩增结果,M：50bp DNA Ladder；1：LNCaP阳性对照；2 3：PCa；4：PIN；5 6：BPH；7：直肠癌；8：直肠癌癌旁；9：结肠癌；10：结肠癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲状腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：软组织纤维肉瘤；17：转移性腺癌；18：淋巴结转移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝脏；21：胆囊；22：胎盘；23：试剂空白。,DD3 mRNA 34外显子扩增结果,M：50bp DNA Ladder；1：LNCaP阳性对照；2 3：PCa；4
8、：PIN；5 6：BPH；7：直肠癌；8：直肠癌癌旁；9：结肠癌；10：结肠癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲状腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：软组织纤维肉瘤；17：转移性腺癌；18：淋巴结转移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝脏；21：胆囊；22：胎盘；23：试剂空白。,前列腺组织和其他肿瘤组织及癌旁组织DD3 mRNA检测结果,M：50bp DNA标准；1：LNCaP阳性对照；2：BPH；3：健康男性志愿者；410为PCa；11为试剂空白。,外周血DD3 mRNA的RT-PCR扩增电泳图,RT-PCR检测结果,44例PCa组中13例可见DD3 mRNA阳性结
9、果(其中B期、C期及D期分别有为0例、2例，11例)。30例BPH患者和18名健康男性志愿者标本中均未检出DD3 mRNA。,外周血DD3 mRNA的巢式RT-PCR扩增电泳图,M：50bp DNA分子量标准；1：LNCaP阳性对照；2：阴性对照(女性)；3：BPH患者；4：健康男性志愿者；58：未治疗的PCa；9：试剂空白,巢式RT-PCR检测结果,44例PCa组中21例可见DD3 mRNA阳性结果(其中B期、C期、D期分别有1例、5例、15例)30例BPH患者和18名健康男性志愿者均未见阳性结果,两种方法对PCa患者外周血DD3 mRNA检出率比较,外周血DD3 mRNA巢式RT-PCR方法的灵敏度,M:50bp DNA分子量标准；16:依次为105、104、103、102、101、1个LNCaP细胞/ml全血；7:阴性对照；8:试剂空白,不同前列腺疾病患者其外周血DD3 mRNA检出率比较,巢式RT-PCR,PCa不同临床分期未治疗组和治疗组DD3 mRNA阳性率比较(%,例数),巢式RT-PCR,谢 谢!,
