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1、肿瘤的分子诊断,Moleculardiagnosis of tumors,多基因疾病是指疾病的发生涉及两个以上基因的结构或表达调控的改变。分子诊断是指利用分子生物学和分子遗传学的方法，通过检测基因的存在、结构变异和表达的异常，对人类状态和疾病做出诊断的方法。肿瘤的分子诊断是指用分子生物学手段，通过检测肿瘤相关基因的存在，分析肿瘤相关基因的缺陷、表达及其功能，以达到肿瘤诊断的目的。,概 念,一、肿瘤发生发展的分子机制,肿瘤自身原因,外因,内因,无限增殖,转移,空间,资源,免疫监控,攘外,安内,同流和污,视而不见,肿瘤免疫监控失活,功能丧失,一、肿瘤发生发展的分子机制,1、肿瘤自身,一、肿瘤发生发
2、展的分子机制,1、肿瘤自身,一、肿瘤发生发展的分子机制,1、肿瘤自身,Self-sufficiency in growth signals,Autocrine loopsOver-expression of receptorReceptor is always onDownstream signals,一、肿瘤发生发展的分子机制,1、肿瘤自身,External triggersIntracellular triggersDeath receptorsCaspasesSensors(8,9)Executioners(3),Evading apoptosis,一、肿瘤发生发展的分子机制,1、肿瘤自
3、身,Insensitivity to antigrowth signals,一、肿瘤发生发展的分子机制,1、肿瘤自身,Sustained angiogenesis,VEGF(血管内皮生长因子)FGF1/2（成纤维细胞生长因子）ThrombospondinThalidomideAvastin,一、肿瘤发生发展的分子机制,1、肿瘤自身,Tissue invasion and metastases,一、肿瘤发生发展的分子机制,1、肿瘤自身,Limitless reproductive potential,Hayflick hypothesisLimited number of doublingsTe
4、lomere maintenanceTelomeraseNot all tumor cells have this potentialTumor stem cells,(1)免疫监视系统,要素,识别力,攻击力,组成,分工,快速反应,特异反应,信息传递,一、肿瘤发生发展的分子机制,2、免疫监控失调,（1）、免疫监视系统,识别,特异反应,抗原递呈细胞,一、肿瘤发生发展的分子机制,2、免疫监控失调,（1）、免疫监视系统,攻击,效应细胞,一、肿瘤发生发展的分子机制,2、免疫监控失调,（2）、免疫监视系统与肿瘤发生,证据,体内细胞突变随时在发生，但肿瘤不是随时发生。,免疫缺陷与肿瘤发生,免疫功能与肿瘤发
5、展,一、肿瘤发生发展的分子机制,2、免疫监控失调,（2）、免疫监视系统与肿瘤发生,肿瘤监控失常原因,识别问题,肿瘤自身,免疫细胞,隐蔽抗原,来源与正常细胞相同,抗原递呈功能缺失,无视,一、肿瘤发生发展的分子机制,2、免疫监控失调,（2）、免疫监视系统与肿瘤发生,肿瘤监控失常原因,杀伤问题,肿瘤自身,免疫细胞,杀伤免疫细胞,抑制因子,功能异常,抑制性免疫细胞,一、肿瘤发生发展的分子机制,2、免疫监控失调,二、肿瘤的分子诊断内容,肿瘤标志物的检测,1978年Herberman在美国国立癌症研究所召开的人类肿瘤免疫诊断会上提出的。由肿瘤组织和细胞产生的与肿瘤的形成、发生相关的物质,这些物质存在于肿瘤
6、细胞的胞核、胞质、胞膜上或体液中；不存在于正常成人组织而见于胚胎组织,或在肿瘤组织中含量超过正常含量。存在于肿瘤患者的组织、体液和排泄物中，能够用免疫学、生物学及化学的方法检测。,原癌基因癌基因病毒癌基因肿瘤抑制基因肿瘤转移相关基因肿瘤耐药基因等,肿瘤相关基因,细胞基因组中调控细胞增殖和分化且具有能够使正常细胞发生恶性转化的基因，包括病毒癌基因和细胞癌基因；癌基因在正常细胞的基因组中存在不表达状态表达水平不足以引起细胞的恶性转化,癌基因：,表1细胞癌基因按其产物定位和功能分类,能够抑制细胞恶性转化或抑制细胞异常 增殖的基因 目前研究较多的有p53基因、pRB基因、p16蛋白、p15蛋白、p21
7、等。,抑癌基因,表2 已确定的几种抑癌基因,野生型P53生物学活性,当DNA损伤的时候,P53基因就明显表达使细胞在G1期生长阻滞，促使细胞凋亡。抑制肿瘤细胞生长保持DNA完整性,包括肿瘤转移促进基因或肿瘤转移抑制 基因。,肿瘤转移相关基因,肿瘤耐药基因,其表达使肿瘤细胞对药物产生耐药的基因。,血小板衍生生长因子（PDGF）表皮生长因子（EGF）VGF基因等,肿瘤生长因子,肿瘤的基因诊断,肿瘤的基因诊断目前主要集中在以下几个方面：肿瘤转移标志物肿瘤抗药基因突变的癌基因肿瘤相关的病毒基因,表3 肿瘤基因诊断的分子标志及其应用,可分为四大类 组织特异性基因标志 肿瘤特异性基因标志 血管生成因子 其
8、它与肿瘤转移相关的分子及基质蛋白酶及其抑制剂,肿瘤转移基因标志物,组织特异性基因标志物,指肿瘤组织和/或起源正常组织所特有，在淋巴组织和血细胞中不存在的。如角质蛋白家族（CK）mRNA、粘蛋白基因、表皮生长因子受体（EGFR）mRNA等。存在于肿瘤及其起源的正常细胞中，不存在于其他细胞。如CEA mRNA、AFP mRNA、PSA mRNA等,血管生成因子,如血管内皮细胞生长因子（VEGF）等。,突变的癌基因,癌基因的突变是癌基因激活的重要方式和途径。除了见到较大范围片段的缺失或插人以及染色体转位之外，大多数情况下，都是少数核苷酸或单个碱基的突变。.癌基因点突变的检测 单链构象多态性（SSCP
9、）检测技术等.,肿瘤相关的病毒基因,EB病毒（EBV）人乳头瘤病毒（HPV）乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）感染,对于这些肿瘤组织细胞中相关病毒基因及其编 码产物的检测，可以作为这些类型的肿瘤诊断的标志。,致瘤病毒引起的恶性转化作用引起了人们极大的关注,肿瘤基因诊断的常用方法,PCR、RT-PCRSouthern blot杂交技术、Northern blot杂交技术基因芯片基因测序。,肿瘤基因的分子诊断意义,1.肿瘤的早期诊断和筛选2.肿瘤疗效监测 3.肿瘤的预后判断 4.肿瘤微转移检测,肿瘤基因检测在肿瘤微转移检测中应用举例,前列腺癌特异性基因DD3PCA3,DD3PCA3是一
10、种非编码RNA的基因，定位于9q2122染色体。它为前列腺癌特异性基因之一，DD3PCA3 mRNA仅在前列腺癌细胞中表达，而在其它正常组织和癌组织以及细胞系中均不表达。,DD3 mRNA 14外显子扩增结果,M：50bp DNA Ladder；1：LNCaP阳性对照；2 3：PCa；4：PIN(前列腺上皮内瘤变)；5 6：BPH(前列腺增生)；7：直肠癌；8：直肠癌癌旁；9：结肠癌；10：结肠癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲状腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：软组织纤维肉瘤；17：转移性腺癌；18：淋巴结转移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝脏；21：胆囊；2
11、2：胎盘；23：试剂空白。,DD3 mRNA 13外显子扩增结果,M：50bp DNA Ladder；1：LNCaP阳性对照；2 3：PCa；4：PIN；5 6：BPH；7：直肠癌；8：直肠癌癌旁；9：结肠癌；10：结肠癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲状腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：软组织纤维肉瘤；17：转移性腺癌；18：淋巴结转移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝脏；21：胆囊；22：胎盘；23：试剂空白。,DD3 mRNA 34外显子扩增结果,M：50bp DNA Ladder；1：LNCaP阳性对照；2 3：PCa；4：PIN；5 6：BPH；7：直肠
12、癌；8：直肠癌癌旁；9：结肠癌；10：结肠癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲状腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：软组织纤维肉瘤；17：转移性腺癌；18：淋巴结转移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝脏；21：胆囊；22：胎盘；23：试剂空白。,前列腺组织和其他肿瘤组织及癌旁组织DD3 mRNA检测结果,M：50bp DNA标准；1：LNCaP阳性对照；2：BPH；3：健康男性志愿者；410为PCa；11为试剂空白。,外周血DD3 mRNA的RT-PCR扩增电泳图,RT-PCR检测结果,44例PCa组中13例可见DD3 mRNA阳性结果(其中B期、C期及D期分别有为0
13、例、2例，11例)。30例BPH患者和18名健康男性志愿者标本中均未检出DD3 mRNA。,外周血DD3 mRNA的巢式RT-PCR扩增电泳图,M：50bp DNA分子量标准；1：LNCaP阳性对照；2：阴性对照(女性)；3：BPH患者；4：健康男性志愿者；58：未治疗的PCa；9：试剂空白,巢式RT-PCR检测结果,44例PCa组中21例可见DD3 mRNA阳性结果(其中B期、C期、D期分别有1例、5例、15例)30例BPH患者和18名健康男性志愿者均未见阳性结果,两种方法对PCa患者外周血DD3 mRNA检出率比较,外周血DD3 mRNA巢式RT-PCR方法的灵敏度,M:50bp DNA分子量标准；16:依次为105、104、103、102、101、1个LNCaP细胞/ml全血；7:阴性对照；8:试剂空白,不同前列腺疾病患者其外周血DD3 mRNA检出率比较,巢式RT-PCR,PCa不同临床分期未治疗组和治疗组DD3 mRNA阳性率比较(%,例数),巢式RT-PCR,谢 谢!,
