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1、致病菌检测方法,福建省疾病预防控制中心 陈路瑶,需要检测的致病菌,乙型溶血链球菌 大肠杆菌 绿脓杆菌 金黄色葡萄球菌 志贺氏菌 沙门氏菌,溶血性链球菌,检测依据：GB/T 4789.11-2003 食品卫生微生物学检验 溶血性链球菌检验,检验程序,检 样,葡萄糖肉汤,血平板,血平板（分纯培养）,链激酶试验,杆菌肽敏感试验,观察溶血,革兰氏染色,报 告,361 24h,361,361,24h,24h,1、菌落特征：,溶血性链球菌菌落特征：灰白色细小针尖样。菌落周围形成一个2-4mm宽、界限分明、完全透明的无色溶血环。,2、革兰氏染色：,乙型溶血性链球菌为革兰氏阳性球菌，在镜下呈现为蓝紫色，圆形，
2、链状排列。,3、杆菌肽敏感试验,乙型溶血性链球菌对杆菌肽敏感，在涂布了该菌菌液的血平板上贴上杆菌肽，36培养1824h，如果有大于10mm的抑菌带出现即为阳性。,4、链激酶试验,乙型溶血性链球菌能产生链激酶，能激活正常人体 血液中的血浆蛋白酶原，凝固形成血浆蛋白酶，而后溶解纤维蛋白。试验中，能使凝固的血浆完全溶解为 溶解链激酶试验阳性。,大肠杆菌,依据：GB15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准 附录B3 大肠菌群检测方法,1、发酵试验,取样液5ml接种50ml乳糖胆盐发酵管，置37培养24h，如不产酸不产气，则报告为阴性，如产酸产气，则进行下一步试验。,2、接种平板,乳糖胆盐发酵试验
3、阳性的管，划线接种伊红美蓝平板。典型的大肠杆菌菌落为黑紫色或红紫色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，有金属光泽，也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉红色，中心较深的菌落。,3、革兰氏染色,取疑似菌落作革兰氏染色镜检，大肠杆菌为革兰氏阴性杆菌，镜下呈红色杆状。,5、复发酵,伊红美蓝平板上的疑似菌落在染色镜检的同时接种乳糖发酵管，如有产酸产气，则可报告检出大肠杆菌。,绿脓杆菌,依据：GB7918.4-87 化妆品微生物标准检验方法 绿 脓 杆 菌,检验程序：,增 菌 培 养,分 离 培 养,染 色 镜 检,氧化酶试验,绿脓菌素试验,硝酸盐还原产气试验,明胶液化试验,42生长试验,报 告,37培养
4、1824h,37培养1824h,1、增菌培养,如有绿脓杆菌生长，培养表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色,2、分离培养,绿脓杆菌菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素。,3、染色镜检,取疑似菌落作革兰氏染色镜检，绿脓杆菌为革兰氏阴性杆菌，镜下呈红色短杆状。,4、氧化酶试验,挑取绿脓杆菌可疑菌落涂在白色滤纸上，加一滴新配制的1%二甲基对苯二胺试液，在1530s内，出现粉红色或紫红色，为阳性，无色或淡黄色为阴性。,5、绿脓菌素试验,取可疑菌落接种绿脓菌素鉴定用培养基，37培养24h,加入氯仿35 mL，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解
5、于氯仿液中，等氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管内并加入1mol/L的盐酸1 mL，振荡，静置片刻，如上层盐酸内出现粉红到紫红色时，为阳性，表示有绿脓菌素存在。,6、硝酸盐还原产气试验,接种被检纯培养物于硝酸盐胨水培养基中，37培养 24h。小倒管中有气体者，为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，产生氮气。,7、明胶液化试验,将可疑菌落穿刺接种在明胶培养基内，37培养24h,取出放冰箱1030min，如何呈溶解状态，即为明胶液化试验阳性，如凝固不溶者为阴性。,8、42生长试验,挑取纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在4142培养箱中24h48h，绿脓菌能生长，为阳性。不能生长为阴性。,
6、金黄色葡萄球菌,依据：GB7918.5-87 化妆品微生物标准检验方法 金黄色葡萄球菌,检验程序,增 菌,分 离,染色镜检,甘露醇发酵试验,血浆凝固酶试验,报 告,37 1824h,37 2448h,1、增菌：,取样液按1：10比例接种到SCDLP液体培养基中，或者可用7.5%氯化钠肉汤，置 37培养箱，培养24h。,2、分离,将增菌培养液划线接种于血琼脂平板置37培养2448h，菌落呈金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。,3、染色镜检,挑取可疑菌落涂片染色镜检，该菌为革兰氏阳性球菌，排列成葡萄状，蓝紫色。,4、甘露醇发酵试验,取上述分纯菌落接种到甘露醇发酵培养基中，置 3
7、7培养箱，培养24h。金黄色葡萄球菌应能发酵甘露醇产酸。,5、血浆凝固酶试验,玻片法：取清洁干燥载玻片上，一端加一滴灭菌生理盐水，另一端滴加一滴血浆，用接种环挑取菌落，分别在生盐及血浆中充分研磨混合。血浆与菌在5min内出现团块或颗粒状凝块时，而盐水滴仍呈均匀混浊无凝固现象都为阳性，如两者均无凝固现象则为阴性。凡玻片试验阴性或盐水滴与血浆滴均有凝固现象，再进行试管凝固酶试验。,5、血浆凝固酶试验,试管法：吸取1：4新鲜血浆0.5ml，加入待检菌24h肉汤培养物0.5ml。混匀，于37水浴或恒温箱中，半小时观察一次，24h 内呈现凝块为阳性。,5、血浆凝固酶试验,乳胶凝集法金黄色葡萄球菌鉴定试剂
8、盒,志贺氏菌,依据：GB 4789.5-2012食品安全国家标准食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验,检验程序,沙门氏菌,依据：GB 4789.4-2010食品安全国家标准食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验,基本操作步骤,1、前增菌：BPW(缓冲蛋白胨水）2、增菌：TTB（四硫磺酸钠煌绿增菌液）SC（亚硒酸盐胱氨酸增菌液）3、分离：BS（亚硫酸铋琼脂）XLD（木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂）HE琼脂 沙门氏菌显色培养基,基本操作步骤,4、生化试验：TSI（三糖铁）赖氨酸 靛基质 尿素琼脂 氰化钾（KCN）培养基 蛋白胨水或直接用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统5、血清学鉴定：O抗原、H抗原、Vi抗原、菌型鉴定,谢谢！,
