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1、第八章 RNA的生物合成(转录),许昌卫生学校,本章内容,第一节 转录的酶和模板第二节 转录过程第三节 真核生物的转录后修饰,转录生物体以DNA为模板合成RNA的过程。,转录,复制和转录的区别,参与转录的物质,原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶(RNA polymerase,RNA-pol)其他蛋白质因子,第一节 模板和酶,转录:以DNA为模板，在依赖于DNA的RNA多聚酶催化下合成与模板互补的mRNA链的过程。转录是基因实现表达的第一步。一、转录模板转录的不对称性就是指以双链DNA中的一条链作为模板进行转录，从而将遗传信息由DNA传递给RNA。能转录出
2、RNA的DNA区段称为结构基因。,能够转录RNA的那条DNA链称为模板链，也称作有意义链。与模板链互补的另一条DNA链称为编码链，也称为反义链。,53,35,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,5GCAGTACATGTC 3,3 c g t g a t g t a c a g 5,5GCAGUACAUGUC 3,NAla Val His Val C,编码链,模板链,mRNA,蛋白质,转录,翻译,模板链、编码链与转录及翻译的关系,转录的连续性：RNA转录合成时，以DNA作为模板，在RNA聚合酶的催化下，连续合成一段RNA链，各条RNA链之间无需再进行连接。转录的单向性：RNA转录合成时，只
3、能向一个方向进行聚合，所依赖的模板DNA链的方向为35，而RNA链的合成方向为53。,二、参与转录合成的酶和蛋白因子,参与RNA转录合成的物质原料：NTP（ATP,UTP,GTP,CTP）。模板：单链DNA。酶：RNA聚合酶（DDRP，RNA-pol）。其他蛋白质因子：如转录因子、终止因子等。,RNA聚合酶（DDRP）这是一种不同于引物酶的依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP）。该酶在单链DNA模板以及四种核糖核苷酸存在的条件下，不需要引物，即可从53聚合RNA。,原核生物中的RNA聚合酶全酶由五个亚基构成，即2。亚基与转录起始点的识别有关，在转录合成开始后被释放；余下的部分（2）被称为核心酶，
4、与RNA链的聚合有关。,真核细胞的RNA聚合酶有三种：分别是RNA聚合酶、RNA聚合酶和RNA聚合酶。RNA聚合酶、RNA聚合酶分别负责合成rRNA和mRNA，RNA聚合酶则催化转录生成5srRNA和tRNA。,第二节 转录过程,RNA的转录过程大体可分为起始、延长和终止三个阶段。转录全过程均需RNA聚合酶催化，原核生物转录起始需要核心酶加上因子即全酶参与。延长过程是核心酶催化下的核苷酸聚合。（Rho）因子参与转录的终止。,一起始阶段 首先由RNA聚合酶的因子辨认DNA的启动子部位，并带动RNA聚合酶的全酶与启动子结合，形成复合物，同时使DNA分子的局部构象改变，结构松驰，解开一段RNA双链（
5、约10几个碱基对），暴露出DNA模板链。在DNA模板链转录起点碱基的引导下，第一个核糖核苷酸进入相应的位置，配对结合。转录起点的碱基多为T或C，因此第一个结合的NTP多为ATP或GTP。,二延长阶段 RNA链的延长是由核心酶催化的。当第一个核糖核苷酸结合后，因子便从全酶中脱落下来。并与另一个核心酶结合成RNA聚合酶全酶，起始另一次转录。脱落的因子可以反复使用。失去因子的核心酶发生构象改变，与DNA模板的结合变得较为松驰，可以沿DNA模板链的下游方向（即35的方向）滑动。在核心酶的催化下，4种核糖核苷酸（NTP）按照模板链碱基排列顺序的指引依次进入，按照U-A,A-T,C-G的碱基配对原则逐个地
6、加到前一个核糖核苷酸的3-OH上，并形成磷酸二酯键。随着核心酶不断沿模板链方向滑动，DNA双螺旋逐渐解开暴露模板链，RNA链沿53方向逐渐延长。此时，已合成的RNA链从5-端逐渐与模板链分离，而模板链与编码链重新结合形成双螺旋(图)。,三终止阶段 当核心酶滑行到DNA模板链的终止部位即停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来，就是转录终止。原核生物转录终止有两种类型：一种是依赖因子终止的转录，因子能与转录产物RNA结合，使RNA聚合酶停顿。因子还有ATP酶活性和解螺旋酶活性，它能利用ATP水解释放的能量，使RNA链从模板DNA链上拆开，并从转录复合物中释放出来。另一种是不依赖因
7、子终止的转录。在DNA模板链上靠近终止处有些特殊碱基序列，即较丰富的A-T配对区或G-C配对区，是转录终止信号。当核心酶遇到终止信号后，RNA转录产物就形成特殊的发夹样结构，阻止核心酶的滑动，RNA链的延长便终止。转录终止后，核心酶也从DNA模板链上脱落下来，与因子重新结合为全酶进行下一次的转录。这样合成的RNA是初级转录物，即RNA前体。如前所述，某些抗生素如利福霉素和利福平能抑制细菌RNA聚合酶，因而能抑制细菌RNA的合成。,第三节 转录后的加工和修饰,真核细胞中转录生成的RNA是初级转录产物，均需经过一定程度的加工才具有活性。原核细胞由于没有细胞核，其结构基因是连续的核苷酸序列，转录后产
8、生的RNA很少需要加工处理（tRNA例外）就转运到核蛋白体上参与蛋白质的合成。新生的无活性的RNA转变为有活性的RNA的过程，称为RNA的成熟（转录后的加工），包括链的断裂、拼接和化学修饰等。,一、mRNA的转录后加工真核生物mRNA转录后，需进行5-端和3-端的修饰以及对hnRNA进行剪接。（一）首尾修饰 指在mRNA的5-端加“帽”，3-端加“尾”。5-端加“帽”是在核内进行的，在hnRNA的5-末端加上一个m7GpppG“帽”结构，其功能与蛋白质生物合成的起始有关。mRNA3-末端接上一段约30200个polyA,该结构称为“尾”，其功能是引导mRNA由细胞核向细胞质转移。,（二）mRN
9、A的剪接 真核细胞的mRNA前体称核内不均一RNA(hnRNA)，它是由断裂基因转录的，包含有内含子和外显子的区段，所以其分子量比成熟的mRNA大几倍，甚至数十倍。剪接就是把hnRNA中的内含子除去，把外显子拚接起来，成为具有翻译功能的模板mRNA。,二、tRNA的转录后加工 1、切除多余的核苷酸.2、剪切内含子：核酸内切酶切除内含子,连接酶进行连接。3、修饰与3末端加-CCA:修饰包括甲基化,脱氨基,还原反应等，在核苷酸基转移酶催化下完成3末端添加CCA。,第九章 蛋白质的生物合成（翻译）,【目的与要求】1、掌握翻译及蛋白质合成体系中的基本概念，如密码子、简并性等。2、掌握蛋白质合成体系的组
10、成及mRNA、tRNA和核蛋白体的作用原理。3、复述蛋白质合成的过程。4、解释分子病的概念，并举例说明。蛋白质的生物合成过程，就是将DNA传递给mRNA的遗传信息，再具体转译为蛋白质中氨基酸排列顺序的过程，这一过程被称为翻译。,第一节 参与蛋白质生物合成的物质,一、合成原料：蛋白质生物合成的原料是氨基酸。氨基酸在mRNA的指引下逐一聚合。聚合过程中，氨基酸需由tRNA携带。蛋白质合成的全过程是在由rRNA和蛋白质所组成的核蛋白体大分子上进行的。也就是说，蛋白质的生物合成，是需要mRNA为模板、tRNA为运载体、核蛋白体为装配场所共同协调完成的。此外，翻译过程还需众多的蛋白质因子和酶的参与。,二
11、、RNA（一）mRNAmRNA是翻译的直接模板。在mRNA分子中，核苷酸的排列顺序包含有多肽链中氨基酸的排列顺序。mRNA通过其模板作用传递DNA的遗传信息，即引导蛋白质多肽链的合成。作为指导蛋白质生物合成的模板，mRNA中每三个相邻的核苷酸组成三联体，代表一个氨基酸的信息，此三联体就称为密码。遗传密码共有64种，其中：,起始密码:AUG终止密码:UAA，UAG，UGA,遗传密码具有以下特点：1.通用性 蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。密码的通用性进一步证明各种生物进化自同一祖先。2.连续性 指编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码间既无间断也无交叉。3.简并性同
12、一氨基酸存在多个不同的遗传密码的现象称为遗传密码的简并性。遗传密码的简并性在保持遗传稳定性上具有重要意义。,4.摆动性：转运氨基酸的tRNA的反密码需要通过碱基互补与mRNA上的遗传密码反平行配对结合，但反密码与密码之间常常不严格遵守碱基配对规律，称为摆动配对。（二）tRNA：tRNA是转运氨基酸的工具 所有tRNA的二级结构均是三叶草形，其氨基酸臂的3-CCA-OH是氨基酸的结合位点，反密码环顶端的反密码子与mRNA上的密码子配对结合。tRNA携带的氨基酸，是由mRNA上三联体密码决定的，因此，tRNA可将氨基酸准确地带到指定的位置。,氨基酸臂,反密码环,tRNA,（三）rRNA与蛋白质构成
13、核蛋白体是蛋白质合成的场所 rRNA是一类分子量不等的非均一性RNA，它们与多种蛋白质互相镶嵌，结合成为显微镜下可见的核蛋白体颗粒，是氨基酸聚合成肽链的场所。核蛋白体由大、小亚基构成。大亚基有转肽酶活性和两个tRNA结合部位，一个是结合肽酰-tRNA的部位（P位），另一个是结合氨基酰-tRNA的部位（A位）。小亚基有结合模板mRNA的功能，在大小亚基之间有容纳mRNA的部位，核蛋白体能沿着mRNA53方向阅读遗传密码。,三个与tRNA结合的位点：A位：又称受位或氨酰基位，可与新进入的氨基酰tRNA结合；由大、小亚基成分构成。P位：又称给位或肽酰基位，可与延伸中的肽酰基tRNA结合；由大、小亚基
14、成分构成。E位：又称排出位，空载tRNA脱离核蛋白体前的结合位点；主要由大亚基成分构成。,核蛋白体大、小亚基的功能,原核生物翻译过程中核蛋白体结构模式,A位：氨基酰位,P位：肽酰位,E位：排出位,三、酶类和蛋白因子（一）氨基酰-tRNA合成酶 氨基酸的活化与携带反应由氨基酰tRNA合成酶催化。特定的tRNA与相应的氨基酸结合，生成氨基酰tRNA，从而由tRNA携带活化的氨基酸参与蛋白质的生物合成。每种氨基酸都有其特异的氨基酰-tRNA合成酶；该酶具有绝对专一性，对其tRNA和氨基酸两种底物能进行高度特异性地识别。,（二）转肽酶 该酶实际上是核蛋白体大亚基上的蛋白质，能催化大亚基P位上的肽酰-t
15、RNA的肽酰基转移到A位上氨基酰-tRNA的氨基上，使酰基与氨基结合形成肽键，延长肽链。（三）其它因子和供能物质1.蛋白因子起始因子（IF）与多肽链合成起始有关的蛋白因子称为起始因子。作用主要是促进核蛋白体小亚基与起始tRNA及模板mRNA结合。,延长因子（EF）与多肽链合成的延伸过程有关的蛋白因子称为延长因子。EF的作用主要促使氨基酰tRNA进入核蛋白的受体，并可促进移位过程。释放因子（RF）与多肽链合成终止并使之从核蛋白体上释放相关的蛋白因子称为释放因子。,RF的生物学功能主要有：识别终止密码，如RF-1特异识别UAA、UAG；而RF-2可识别UAA、UGA。诱导转肽酶改变为酯酶活性，相当
16、于催化肽酰基转移到水分子-OH上，使肽链从核蛋白体上释放。,多肽链合成时，需ATP、GTP作为供能物质，并需Mg2+、K+参与。氨基酸活化时需消耗2分子高能磷酸键，肽键形成时又消耗2分子高能磷酸键，故缩合一分子氨基酸残基需消耗4分子高能磷酸键。,2.供能物质和无机离子,第二节 蛋白质生物合成的过程,蛋白质生物合成过程包括三大步骤：氨基酸的活化与搬运；活化氨基酸在核蛋白体上的缩合；多肽链合成后的加工修饰。本节主要介绍活化氨基酸在核蛋白体上的缩合过程，这一过程包括多肽链合成的起始、延长和终止三个阶段。,一、氨基酸的活化与转运在蛋白质分子中，氨基酸借其氨基与羧基互相连接，形成肽键。但氨基与羧基的反应
17、性不强，必须经过活化才能彼此相连。如前所述，在氨基酰-tRNA合成酶的催化下，氨基酸与tRNA结合成为氨基酰-tRNA的过程叫做氨基酸的活化。以氨基酰-tRNA形式存在的活化氨基酸即可投入氨基酸缩合成肽的过程。,二、肽链的合成（一）肽链合成的起始.1.核蛋白体大、小亚基分离：IF-1和IF-3与小亚基结合，促进核蛋白体大、小亚基拆离，为新一轮合成作准备。,2mRNA与核蛋白体的小亚基结合原核mRNA的起始部位由一段富含嘌呤的特殊核苷酸顺序组成，称为S-D序列（核蛋白体结合位点，RBS）。而原核16S rRNA存在一段富含嘧啶的序列，二者之间可通过碱基配对，使mRNA与核蛋白体小亚基结合。,3.
18、起始氨基酰tRNA(fMet-tRNAimet)结合到小亚基,起始 fMet-tRNAimet以及IF2-GTP一起，识别结合小亚基P位，并对应模板mRNA的起始密码AUG。,IF-3,IF-1,IF-2,-GTP,-GDP,Pi,4.核蛋白体大亚基结合，起始复合体形成：,IF2结合的GTP被水解，三种IF脱离，50S大亚基与30S小亚基、模板mRNA以及起始fMet-tRNAifMet构成起始复合体。,（二）肽链的延长起始复合物形成后，随即对mRNA上的遗传密码进行连续地翻译，即各种氨基酰-tRNA按照mRNA上三联体密码子的顺序依次进入核蛋白体上，使肽链延长。翻译过程的肽链延长也称为核蛋白
19、体循环，每次循环可分为进位（注册）、成肽和转位三个步骤。每循环一次，肽链延长一个氨基酸，如此不断重复，直到肽链合成终止。这一过程需要肽链延长因子（EF）、GTP、Mg2和K的参与。,1.进位：,又称注册，指根据mRNA上遗传密码的指引，进入核蛋白体大亚基的A位。在起始复合物中，大亚基上对应于mRNA的第二位密码子的A位是空着的。起始复合物形成后，由mRNA上的第二位密码子决定的氨基酰-tRNA进入A位，并通过其反密码子与密码子互补结合。此步骤需GTP，Mg2+，和EF-T参与。,2转肽 在大亚基上的转肽酶的催化下，P位上的fmet-tRNAfmet中甲酰甲硫氨酸的酰基转移到A位，与A位上的氨基
20、酰-tRNA的氨基结合成第一个肽键，这样就在A位上形成一个二肽酰-tRNA，P位上的tRNA随之从大亚基上脱落下来。此时P位成为空位。成肽过程需要Mg2和K的参与。,3转位 上述二肽形成之后，在转位酶催化下，并在EF-G和Mg2的共同参与以及GTP供能的情况下，核蛋白体向mRNA的3端方向移动相当于一个密码子的距离，此时A位上的二肽酰-tRNA移至P位，A位留空，而mRNA上的第三个密码子与空着的A位相对应。至此，第一循环完成，又回复到循环开始时的状态，所不同的是，此时P位上由循环开始时的fmet-tRNAfmet变成了二肽酰-tRNA。接着，第三号氨基酸就按第三个密码子的指引进入A位注册，开
21、始下一轮 循环，形成三肽酰-tRNA。同样地，按进位-成肽-转位循环一次，就在肽链上增加一个氨基酸残基。可见，核蛋白体阅读mRNA密码子是从5向3方向进行的，而肽链的合成是从N-端向C-端方向进行的。蛋白质多肽链合成的速度很快，据估算，每秒钟可翻译约40个密码子，即每秒钟可以使肽链延长40个左右氨基酸残基。,核蛋白体循环的反应过程,（三）翻译的终止 翻译的终止包括：终止密码的辨认，肽链从tRNA上水解释出，mRNA脱离核蛋白体，大小亚基解聚。当肽链延长直到A位出现终止密码（UAA、UAG、UGA），无氨基酰-tRNA与之对应，此时，释放因子（RF）能识别终止密码，进入A位。RF与大亚基的结合，
22、可诱导转肽酶变构，激活转肽酶，使P位上的多肽链从tRNA上分离；然后由GTP供能，使tRNA、RF和mRNA均从核蛋白体上脱落下来；在IF的作用下，核蛋白体解聚成大、小亚基。解聚后的大、小亚基又可重新进入翻译过程，循环使用。狭义上，核蛋白体循环指翻译延长，广义上则包括整个翻译过程。,多肽链合成的终止过程,多肽链合成终止演示,RF,三、蛋白质合成后加工和输送从核蛋白体释放出的新生多肽链不具备蛋白质生物活性，必需经过不同的翻译后复杂加工过程才转变为天然构象的功能蛋白。（一）N-端加工去除N末端蛋氨酸残基,四、蛋白质合成与医学的关系（一）、分子病 因DNA分子基因的缺陷,使某种蛋白质分子一级结构的氨
23、基酸序列发生改变导致的遗传病，称为分子病。例：镰刀形红细胞贫血。病因：编码血红蛋白b链的基因，其DNA上的T被A代替，导致b链氨基端第6位的谷氨酸被缬氨酸代替。,（二）、蛋白质合成的抑制剂 蛋白质生物合成自复制、转录和翻译的不同过程均有抑制剂能加以阻断。抑制剂包括抗菌素和毒素等。1.抗生素四环素族：（土霉素等）作用:抑制氨基酰-tRNA与原核细胞的小亚基结合,此类抗生素不易进入哺乳动物细胞。氯霉素：（红霉素）作用与原核细胞的大亚基结合,对真核线立体合成有阻断作用。,抗生素抑制蛋白质生物合成的原理,2.干扰素病毒感染宿主后，细胞产生一类蛋白因子，它抑制病毒的繁殖保护宿主。作用原理：当双链RNA病毒存在时,干扰素使病毒蛋白质合成受抑制，使病毒无法繁殖。作用机制：1、当双链RNA病毒存在时，干扰素活化一种蛋白激酶,激酶使启动因子eIF2磷酸化而失活，从而抑制蛋白合成。2、干扰素间接活化一种核酸内切酶，此酶使病毒mRNA降解,从而阻断蛋白质合成。,第十章分子生物学常用技术和人类基因组计划,
