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1、益气活血药对心肌组织及H9C2细胞Cx43表达和凋亡的影响,吴爱明，娄利霞，高永红，张冬梅，朱海燕，王硕仁北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部和北京市重点实验室,2,主要内容,3,研究背景,心肌缝隙连接蛋白43,心肌细胞凋亡,心血管系统疾病是危害人类健康的常见病。心肌缝隙连接蛋白43和细胞凋亡的异常在心血管疾病的发病过程中都扮演了重要角色。,4,心肌缝隙连接蛋白43(CX43),缝隙连接是一种特殊膜结构，由两个连接子对接而成，每个连接子包含来自毗邻细胞的六个连接蛋白，直接连接两个细胞的胞质，允许相邻细胞间电信号和化学信号的直接通讯。连接蛋白家族有20多个成员，就心室而言，表达最丰富的是Cx
2、43。,5,Cx43是维持心肌细胞间化学偶联和电偶连的关键结构,心肌缺血时，Cx43分布和表达异常会导致心肌细胞电偶联的缺失，易于发生室性心律失常甚至猝死。并且Cx43的异常还会导致心肌细胞间的代谢障碍。,6,心肌细胞凋亡,细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是一种生理现象，但病理状态下细胞凋亡的增加与心肌缺血、缺血再灌注损伤和心力衰竭的发生都密切相关。,过度的细胞凋亡会加速心肌细胞的丢失，造成心功能的恶化，并促进心室重构的发生和发展。,7,材料与方法,8,实验材料,实验动物雄性SD大鼠，体重200240g，许可号：SCXK（京）2006-0009。实验细胞Rat H9C2心肌细胞系（ATCC Num
3、ber：CRL-1446）实验用药生脉注射液（红参、麦冬、五味子），10ml/支，雅安三九药业有限公司（批号：100301）血塞通注射液（三七总皂苷），250mg/10ml/支，昆明制药集团股份有限公司（批号：10DL04）。主要试剂兔抗Cx43多克隆抗体（批号：10440704）Hoechst凋亡细胞核和凋亡小体染色试剂盒（#C1100）,9,实验方法,10,整体实验分组与给药方法,大鼠随机分为：益气活血组：生脉注射液联合血塞通注射液卡托普利组：卡托普利模型组：生理盐水假手术组：生理盐水连续给药一个月,11,心肌梗死大鼠模型制备,参照文献，采用冠脉结扎法制作大鼠心肌梗死模型。王硕仁,王振涛,
4、赵明镜,李敏.心气虚病证动物模型及其评价体系的构建.中国实验动物学报.2002;10(1):33-38.,12,心梗模型大鼠心电图和心脏超声评价,结扎冠脉前 结扎冠脉后,模型组 心功能比较,采用心电图和心脏超声评价心梗大鼠造模是否成功。术后与术前比较，大鼠心电图ST段明显抬高。取材前超声检查显示模型大鼠左心室内径明显扩大，室壁变薄，收缩运动减弱，心功能降低。,13,在体电刺激诱发室颤实验方法,参照文献，大鼠麻醉后固定，呼吸机辅助呼吸，开胸暴露心脏，连接刺激电极。采用程控电刺激诱发室颤，记录室颤阈值。柴松波,王硕仁,姚立芳,等.参松养心胶囊对大鼠心梗后心肌重构和和室颤阈值影响的研究.中国中药杂志
5、.2009,34(16):2101-2104,14,细胞实验分组与给药方法,正常对照组模型组血塞通低剂量组血塞通高剂量组,细胞实验以大鼠H9C2心肌细胞系为研究对象，分为两个实验。实验1：生脉联合血塞通注射液对H9C2细胞Cx43损伤的影响实验2：生脉联合血塞通注射液对H9C2细胞凋亡的影响两个实验均分为以下八组,生脉低剂量组生脉高剂量组生脉和血塞通低剂量组生脉和血塞通高剂量组,15,细胞实验1：诱导H9C2细胞Cx43损伤的方法,参照文献，采用TPA造成Cx43的损伤。TPA是一种蛋白激酶C的激活剂，可以增加Cx43的磷酸化，从而降低Cx43通道的通透性，还能显著地降低缝隙连接的组装，并使C
6、x43失去稳定性。Lampe PD,TenBroek EM,Burt JM,et al.Phosphorylation of connexin43 on serine368 by protein kinase C regulates gap junctional communicationJ.J Cell Biol,2000,149(7):1503-1512.Lampe PD,Lau AF.The effects of connexin phosphorylation on gap junctional communicationJ.Int J Biochem Cell Biol,2004,3
7、6(7):1171-1186.,16,细胞实验1：H9C2细胞Cx43检测方法,采用免疫细胞化学法检测Cx43的表达主要步骤：用4%多聚甲醛固定细胞15min，血清封闭，滴加1:100稀释一抗4孵育过夜。次日加二抗，37孵育30min，DAB显色，倒置显微镜拍照观察。,17,细胞实验2：诱导H9C2细胞凋亡的方法,参照文献，使用Ang诱导心肌细胞凋亡。血管紧张素（Ang）是一种生物活性物质，可使血管收缩，血压升高，并能够诱导心肌细胞的凋亡。裴兆辉,马虹,朱妙章等.血管紧张素诱导心肌细胞凋亡机制的研究进展J.心脏杂志,2005,17(5):482-483.,18,细胞实验2：H9C2细胞凋亡检测
8、方法,采用Hoechst染色法检测细胞凋亡主要步骤：用4%多聚甲醛固定细胞，PBS洗涤1次，加入Hoechst染色液，室温孵育10min，吸弃染液，PBS洗涤1次，倒置荧光显微镜观察拍照，分析凋亡细胞占总细胞数的百分比。,19,统计学方法,采用SPSS13.0软件进行统计处理，实验数据以均数标准差(X)表示。先进行正态性和方差齐性检验，符合正态分布且方差齐的数据采用单因素方差分析，不符合正态分布的采用非参数检验，P0.05为差异有统计学意义。,20,结 果,21,前期工作,课题组前期对心肌梗死大鼠模型进行了中医证候和西医病理方面的中西医结合研究。其中基因表达谱芯片的工作提示：心肌缝隙连接和细胞
9、凋亡是心梗大鼠基因差异表达的聚集点之一。据此线索，本研究重点观察益气活血药对心肌缝隙连接和凋亡的影响。,22,心肌梗死大鼠差异基因的生物信息学分析,23,心肌梗死大鼠心肌Cx43 mRNA和蛋白表达的变化,在芯片实验基础上，对心梗大鼠Cx43的基因和蛋白表达进行了验证，结果同样证实心肌梗死发生后Cx43 mRNA和蛋白的表达均明显降低。,24,心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡率变化,在凋亡方面，我们动态观察了从冠脉结扎术后3天到12周，心肌细胞凋亡率的变化，模型组在各个时点凋亡率均明显高于假手术组。并且从3天到4周，模型组凋亡率先呈下降趋势，而后从4周到12周凋亡率又逐渐增加。,25,整体动物实验结果
10、,基于以上前期工作，本研究首先进行动物实验，从组织水平观察益气活血药的心脏保护作用。动物实验分为以下4部分：在体电刺激诱发室颤实验心脏形态结构改变心肌Cx43基因表达检测心肌Cx43免疫组化实验,26,动物实验1：益气活血药对在体电刺激诱发室颤的阈值影响,室颤阈值的降低，表明心脏电稳定性差，容易发生室颤。与假手术组比较，心梗模型组室颤阈值降低，益气活血药治疗后室颤阈值提高。,27,动物实验2：心脏大体形态结构比较,取材时可见，模型组大鼠梗死范围较大，室壁变薄和心腔扩大明显。益气活血药治疗后，梗死范围有一定程度的缩小。,28,益气活血药对心梗大鼠脏体比值（全心重/体重）的影响,心肌梗死大鼠的心重
11、/体重比明显增加，益气活血药治疗后，脏体比值下降。,29,益气活血药对心梗大鼠左心室内径的影响,模型组左心室内径明显高于假手术组，益气活血药治疗后，左室内径变小。,30,益气活血药对心梗大鼠心肌梗死百分比的影响,益气活血药治疗后，心肌梗死范围明显缩小。,31,动物实验3：益气活血药对心梗大鼠心肌Cx43 mRNA表达的影响,心肌梗死大鼠Cx43 mRNA表达明显降低，益气活血药治疗后Cx43 mRNA表达增加。,32,动物实验4：心肌Cx43免疫组化染色,免疫组化染色心肌Cx43呈棕黄色颗粒表达，假手术组界线清晰成线状排列，主要位于闰盘内，分布整齐。模型组Cx43表达明显减弱甚至消失，残存的C
12、x43界线不清，分布紊乱。与模型组比较，益气活血组和卡托普利组Cx43表达增加，分布比较整齐。,33,益气活血药对心梗大鼠心肌Cx43蛋白表达的影响,图像分析显示，模型组Cx43表达的强度和阳性面积均低于假手术组；益气活血药治疗后，Cx43的表达和面积均显著增加。,34,细胞实验,在动物实验基础上，本研究进一步开展细胞实验，拟从心肌Cx43和细胞凋亡角度，探讨益气活血药的药效机制。细胞实验分为以下两部分：生脉注射液联合血塞通注射液对H9C2细胞Cx43损伤的影响 生脉注射液联合血塞通注射液对H9C2细胞凋亡的影响,35,细胞实验,细胞实验以大鼠H9C2心肌细胞系为研究对象，H9C2来源于胚胎期
13、心脏，具有心肌细胞的特性，可以模拟心肌细胞，常用于与心肌细胞相关的机制研究。,H9C2细胞HE染色 200 H9C2细胞HE染色 400,36,细胞实验1：生脉联合血塞通注射液对H9C2细胞Cx43损伤的影响,细胞免疫化学染色显示，Cx43呈棕黄色表达，TPA刺激H9C2细胞后，Cx43的表达明显降低。单独使用血塞通注射液或生脉注射液干预都可以增加Cx43的表达，而二者联合使用效果更佳并且高剂量趋势更明显。,37,细胞实验2：生脉联合血塞通注射液对H9C2细胞凋亡的影响,Hoechst染色是一种经典而快速的细胞凋亡检测方法。正常细胞染色后细胞核呈蓝色；细胞发生凋亡时，染色质固缩，细胞核会呈致密
14、浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色高亮。,38,结果显示：Ang处理后H9C2细胞凋亡率显著增加，血塞通注射液和生脉注射液都具有降低凋亡率的作用，其中生脉注射液和血塞通注射液联合使用时抑制凋亡的效果最明显。,细胞实验2：生脉联合血塞通注射液对H9C2细胞凋亡的影响,39,讨 论,40,讨论,Cx43异常是引起心脏电重构而诱发心律失常重要因素之一；而凋亡的过度增加会加速心肌细胞丢失，心功能恶化，促进心室重构的发生发展。Cx43与凋亡的关系比较复杂：一方面由Cx43组成GJ开放时，有利于凋亡信号的传递，促进心肌细胞的凋亡；另一方面心肌缺血使Cx43遭到破坏，相邻心肌细胞间物质和信号快速交换的通道被切断
15、，又不利于心肌细胞的同步运动、新陈代谢和生存。但是无论如何，心肌Cx43损伤和心肌细胞凋亡的增加都是导致患者病情恶化甚至猝死的病理学基础。,41,本研究首先进行整体动物实验，发现益气活血药具有提高心梗大鼠的室颤阈值、缩小心肌梗死面积、改善左室重构等心脏保护作用。在此基础上进一步开展细胞实验，主要从心肌Cx43和细胞凋亡角度，探讨益气活血药的药效机制，结果证明益气活血药联合应用能够保护心肌Cx43和抑制心肌细胞的凋亡。相关研究结果，为临床应用益气活血药治疗缺血性心脏病提供了有益参考，值得进一步深入研究。,42,致谢,感谢大会给予交流机会！感谢北京中医药大学东直门医院王硕仁教授、娄利霞、高永红、张冬梅、朱海燕全体课题组成员的贡献！,43,敬 请 指 正,北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部和北京市重点实验室2012年9月 南京,
