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1、膜蛋白的晶体学研究,生物大分子结构研究的方法概况(1)X光晶体衍射（Xray）：这是目前生物大分子结构解析最有效的一种方法，它有赖于高度有序的三维晶体的获得。(2)核磁共振（NMR）：这种方法已成功地用于菌视紫质及有机溶剂中细菌F1F0ATP酶的F0膜功能区的C单元的结构解析。(3)电镜（EM）二维晶体及三维重构：目前，电子晶体学阐述的结构达到3埃的分辨率。,已测定的膜蛋白晶体结构(原子分辨水平),蛋白质晶体的类型 由于分子之间相互作用的性质不同，蛋白分子可以形成三种不同类型的晶体，即三维晶休、二维晶体和二维晶垛(stacks of 2D crystals)。其中，维系分子之间形成三维晶体的相
2、互作用主要来自亲水相互作用；而在二维晶体中，膜包埋区域疏水相互作用是维系晶体结构的主要作用；对二维晶垛，膜包埋区域仍是疏水作用，而层间则是亲水作用。,膜蛋白三维结晶,去污剂-蛋白微团 形成的三维晶体,晶体生长现象 从溶液中结晶是一个很普遍的自然现象，对于小分子、无机盐、水溶性蛋白和膜蛋白而言，结晶的原理都是相同的。为了使体系发生结晶，必需通过改变一个或者更多的物理参数如浓度、温度、离子强度等来达到溶液的过饱和状态。通常而言，这个过程变化越缓和，结晶过程就越好控制，高度有序的晶体就更易于得到。结晶包括两个连续的过程：成核和晶体生长。成核过程是一个可逆的过程。当晶核长大到一定程度时，它将进一步不可
3、逆地长大，形成一个新相，进而形成稳定的晶体。从微观角度而言，每一个分子具有六个自由度，三个水平和三个旋转自由度，它们通过有序的堆积使体系的熵减少。在蛋白经过有序堆叠形成晶体的同时，相邻分子间形成新键，进而降低体系的自由能，这是形成结晶的驱动力。,水溶性蛋白和膜蛋白在结晶性质上的差异：水溶性蛋白和膜蛋白在结晶性质上的差异主要是由其溶解性存在差异的结果。溶解性的差异往往由蛋白的表面性质、蛋白的取向极性，或者它们两者共同造成的。水溶性蛋白暴露出极性表面，在水溶液中各相同性。整合膜蛋白是双亲性的，一般是垂直插过脂双层膜，它具有锚在膜上的疏水核心，以及指向胞质侧和胞外侧的两个极性表面。尽管膜蛋白难于形成
4、三维结晶，经过艰苦的摸索也有成功的例子。首先报道的菌视紫质和红细胞膜孔蛋白的三维结晶是从水溶性去污剂溶液中得到的。最近，在膜蛋白的三维结晶中又引入了两个新的概念，同时这两种新途径都获得了高分辨率的晶体结构。其中之一是细菌色素C氧化酶与其构象专属性单克隆抗体的Fv片段采用共晶方法得到的；另外一个是通过脂立方相技术得到的。,膜蛋白三维结晶需要分子伴侣：1)去污剂：De Grip在研究质子受体视紫质和视蛋白在不同去污剂溶液中的稳定性时发现以下经验性规则：(1)在分子大小相当时，非离子去污剂比兼性离子去污剂要温和。(2)在同系物中，烷基链较长的去污剂较温和。(3)在同样烷基链的情况中，头部体积越大的去
5、污剂越温和。在Rhodopseudomonas viridis 的反应中心的晶格中发现，极性的相互作用发生在蛋白之间、蛋白与胶束之间以及胶束之间。去污剂的种类和大小对于这些相互作用来说是很关键的，对于一定的膜蛋白其选择范围很狭窄。膜蛋白三维结晶中往往采用一些烷基链较短，头部较小的去污剂，这样能形成较小的胶束以使得膜蛋白本身具有最大的极性接触面积来形成结晶。,膜蛋白三维结晶需要分子伴侣：2).添加剂 在很多情况下，中性或带电的双亲小分子能改善膜蛋白的三维结晶或是其结晶所必需。在光合作用反应中心的结晶中，添加剂的加入使得与反应中心相互作用的去污剂的数量减少。在膜孔蛋白的结晶中，辛基寡聚还氧乙烯的加
6、入可减慢结晶的速度。苯脎脒定的加入使得菌视紫质在含OG的溶液的溶解增多。异丙醇的加入可增大菌视紫质的晶体尺度。而且有些添加剂能自身结晶从而为膜蛋白的结晶形成晶核表面。Michel 提出双亲小分子的概念，去污剂/添加剂所形成的胶束比纯去污剂所形成的胶束要小一些，这样更有利于胶束在晶格中的堆积。Garavito 指出添加剂能提高胶束的变形性，使得它们更适合于在晶格中的堆叠。,膜蛋白三维结晶需要分子伴侣：3).沉淀剂 在膜蛋白的三维结晶中，沉淀剂的使用受到较大的限制：大多数情况下采用PEG 和高浓度的盐。PEG通过竞争体系中的水分子而改变溶质的结构，PEG浓度的提高可引起沉淀或相分离，PEG也能降低
7、OG的共溶边界。在膜蛋白结晶中常采用高盐浓度。如硫酸铵、磷酸铵等，它们能改变去污剂的溶解性。如在菌视紫质的立方相结晶中常采用磷酸钠或磷酸钾作为沉淀剂。,膜蛋白三维结晶的新方法(1)-膜蛋白与单克隆抗体Fv片段的共晶 Michel 等通过分析已知的膜蛋白晶体结构得知：大多数突出的晶格接触是通过膜蛋白膜外区域的极性部分形成。因此，他们探索膜蛋白和另外一个能与之特异、紧密结合的蛋白在同一体系中共晶生长并取得了成功：细胞色素C氧化酶与单克隆抗体Fv片段的共晶生长，得到了紫红色的2mm长，直径为0.6mm四棱晶体。在这一个2.8埃分辨率的结构中，发现所有的极性相互作用都是由Fv片段介导的，细胞色素C氧化
8、酶不直接参与相互作用。该结果说明：Fv片段对膜蛋白的结合，增加了它的极性表面，促使膜蛋白的三维结晶。,膜蛋白三维结晶的新方法(2)-脂立方相系统 脂立方相是宏观稳定、半固态、粘稠和澄清的基质材料。极性和脂溶性的物质在其中均易于发生扩散。水溶性蛋白和膜蛋白在膜上的锚定并不影响脂立方相的宏观性质。糜蛋白酶插入到脂立方相中仍能保持天然构象和酶活性。很多膜蛋白也可以插到脂立方相后仍保持天然构象和酶活性，这比膜蛋白溶在去污剂中更为稳定。脂立方相除了具有高度的结构性及易于紧密堆叠的性质，它的可塑性使得其能容纳一系列大分子样品。水溶液中分子的结晶存在六个自由度（三个水平方向的，三个螺旋方向的），而在双连续立
9、方相中的结晶则只有三个自由度（两个水平方向的，一个螺旋方向的），这对脂立方相结晶是较理想的。上述讨论说明脂立方相是一种有利于膜蛋白成核以及三维晶体生长的新系统。,蛋白质的二维结晶化,电子晶体学的发展 电子晶体学的结构分析源于早期的电子衍射分析。与X射线衍射方法相类似，电子衍射数据的实验分析一般得到的只是结构因子的振幅部分，丢掉了相位信息。因此在其后的许多年里，一些科学家尝试把X射线晶体学寻找相位的方法用于电子衍射的分析中，并取得了一定的成果。但是电子晶体学真正发展成为一种独立的空间结构的分析方法并从传统X射线晶体学中脱胎出来，应从剑桥MRC分子生物学实验室的Klug和DeRosier建立了三维
10、重构的方法开始。这一方法的基本思路是电子显微图像含有振幅和相位的信息，二者可通过数字图像处理的傅立叶变换方法提取出来。Klug等用该技术对T4烟草花叶病毒颗粒进行了研究，并根据电镜照片重构了病毒颗粒尾部的三维空间结构，从而开辟了分子生物学领域中一个崭新的结构研究领域。其后相当一批生物大分子的结构，其中包括一些膜蛋白，应用电子晶体学方法被确定下来。在这些成果中，Henderson和Unwin于1975年发表的关于细菌视紫红质（BR）的7埃分辨率的工作是电子晶体学上的一个里程碑，该工作第一次给出了膜整合蛋白的结构。1982年Klug因此获得了诺贝尔化学奖。,电子晶体学的发展 最近十年来，随着计算机
11、图像处理技术、电子显微镜技术及生物样品二维结晶技术的发展和完善，电子晶体学已经发展成为一种X射线晶体学所不可替代的生物大分子空间结构分析的有效手段。Henderson等人于1990年把细菌视紫红质的研究提高到了3.5埃的分辨率，并在此基础上提出了这种蛋白质的一种原子模型。用体外重组方法生长的一些膜蛋白的二维晶体，如细菌外膜的porin OmpF和 PhoE，植物捕获光能复合体 LHC-II等，都获得了接近原子水平的空间结构。用脂单层方法生长的水溶性蛋白质straptavidin的二维晶体，也获得了3埃的高分辨率。,二维晶体的形成 天然膜中形成二维结晶的特点是：所有的蛋白在脂双层中都有相同的取向
12、。这里既包括囊泡状晶体，也包括管状晶体。后者可以看成是一种蛋白质分子沿柱体表面螺旋排列的一种特殊的囊状晶体。在去垢剂溶液中人工组装的二维晶体，蛋白分子以相互间隔的取向排列，因此膜的两侧性质是相同的。在脂单层表面也可以人工组装二维晶体，这既包括某些膜外周蛋白，也包括某些水溶性蛋白(通过特异性或非特异性吸附抛锚于膜表面)。,脂双层中的蛋白质二维晶体(a)呈囊泡状的天然膜二维晶体(b)呈管状的天然二维晶体(c)去污剂溶液中人工组装的二维晶体,蛋白质在脂单层表面上二维结晶化(a)蛋白质通过特异性结合在膜表面上形成二维晶体(b)蛋白质通过非特异性的吸附在膜表面形成二维晶体,二维晶垛的形成,某些情况下，在
13、二维晶体表面会外沿生长出新的二维晶体，即形成二维晶垛。此时，层内是疏水相互作用而层间则是亲水作用。这种不同性质的相互作用可通过改变实验条件予以增强，可以形成几层以至几百层的堆垛薄层。而且有可能形成三维晶体。,1.天然膜中蛋白的二维结晶化 BR天然条件下可以在嗜盐菌(Halobacterium halobium)的质膜上形成片状的二维晶畴，即紫膜。所有的BR分子在膜中都有相同的指向。天然条件下的紫膜面积较小，不适于高分辨的电子晶体学分析。采用OG(octyl glucoside)和DTAC(dodecyl triammonium chloride)等阳性去垢剂作为添加剂后，天然BR晶畴可以融合成
14、直径为20m的大片二维晶体。它是第一个获得空间结构的膜蛋白。,在一些特殊的生物膜中某种膜蛋白可能具有很高的含量，此时，可以通过适当的物理或化学因素诱导蛋白在膜内二维有序化,也可以抽提膜内其它成分或加入适当添加剂而促进蛋白的二维结晶。,从地中海电鳗的电器官上可以获得饱含乙酰胆碱受体的膜小泡。膜泡上的受体分子开始是稠密而随机地分布的，但在417情况下温育2个星期后形成了管状的二维晶体。这是低温相分离诱导膜内蛋白二维有序化的一个例子。,2.去垢剂蛋白微团的二维结晶化 尽管天然膜中形成蛋白二维晶体的例子很多，但高质量的二维晶体还是由纯化的膜蛋白重组而成。此时结晶条件易于控制，结果的重复性也更好。目前二
15、维结晶中常用的方法就是利用去除去垢剂使膜蛋白在脂双层中重组。分离纯化的膜蛋白先加到去垢剂溶液中，然后加到磷脂一去垢剂微囊泡的悬浊液中。通过透析或吸附的方法去除去垢剂而使膜蛋白在脂双层中富集形成二维晶体。某些情况下，可以采用“一炉”生长二维晶体的方法(the batch method)。此时，生长晶体的混合溶液一次配成，在整个实验过程中浓度不变。细菌视紫红质(BR)和植物光捕获中心的复合体(LHC-)都用这种方法得到了高质量的二维晶体。,3.脂单层表面的二维结晶化 借助LB膜技术,还可以实现分子组装.生物大分子在脂单层膜上的二维结晶化就是利用这种技术实现的一种构思巧妙的蛋白质组装的方法。目前这种
16、方法可分为两大类：通过生物大分子(蛋白质或酶)与膜上带有的特异配体的识别、结合来使得大分子有序化；通过大分子和LB薄膜间的静电或疏水作用来实现。蛋白质在脂单层表面形成二维晶体的条件：(1)蛋白质在脂单层表面的富集；(2)富集在脂单层表面的蛋白质要取向一致；(3)富集在脂单层表面的蛋白质要有足够的侧向移动的能力。满足上述条件的蛋白质才能自组装形成规则的网格状晶体，即具有周期性结构的二维晶体。,在脂单层表面形成的蛋白二维晶体向固体衬底表面转移的示意图,三维重构的基本原理(中心截面定理)将电子显微图像(实空间)进行傅里叶变换(倒易空间)，一张显微图像的傅里叶变换相应于成像物体在三维傅里叶变换(倒易空
17、间)的一个通过中心的截面。通过改变生物样品在电镜下的倾斜角度，就可以得到相当于傅里叶变换(倒易空间)的其它通过中心的截面。收集在不同倾斜角度下样品的显微图像，经过傅里叶变换就可以获得一套完整的三维倒易空间数据。对样品的三维倒易空间数据进行傅里叶逆变换运算就可以获得该样品在实空间的三维结构图像。对于具有螺旋对称性的生物大分子复合体系，一个图像就代表各个方向的投影，所以理论上由一个图像的傅里叶变换可以提供三维重构的全部信息。对于非螺旋对称性的粒子，必须由不同的投影图获得足够多的数据，而且还要对数据进行差值处理,以便得到傅里叶空间的三维图象。,电镜照片的数字化傅里叶变换谱峰的指认、晶格参数的优化振幅和相位信息的提取相位原点的确定判定晶体的空间群特征按对称性进行平均傅里叶逆变换重构的大分子电子密度投影结构,三维重构梗概,谢谢收看,
