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1、武汉设计工程学院大学生创新训练计划项目申请书项目编号项目名称产虾青素微生物的分离、鉴定及培养条件优化项目负责人陈思音联系电话所在学院食品与生物科技学院学号专业班级生工2201指导教师石玉/冯光志E-maiIShiy申请日期2023.5.5起止年月2023年9月至2024年12月武汉设计工程学院制二。二三年五月填写说明1、本申请书所列各项内容均须实事求是，认真填写，表达明确严谨，简明扼要，空缺项要填“无”。2、“项目编号”一栏不填。3、项目所属一级学科：按照中华人民共和国学科分类与代码简表（国家标准GB/T13745-2009）填写4、格式要求：表格中的字体采用小四号宋体，单倍行距；需签字部分由
2、相关人员以黑色钢笔或签字笔签名。5、负责人所在学院认真审核，经初评，签署意见后，将申请书（一式三份）报送科技处办公室。一、基本情况项目名森产虾青素微生物的分离、鉴定及培养条件优化所属一级学科生物工程申请金额5000元起止年月2023年6月至2024年12月负责人姓名陈思音性别女民族汉出生年月2004年11月学号联系电话宅：手机：指导教师石玉/冯光志联系电话宅：手机：/负责人曾经参与科研的情况参与指导老师科研课题湖北省教育厅项目B和湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队计划项目T的研究，已熟练掌握相关实验技术。指导教师承担科研课题情况主持2020年度湖北省高校优秀中青年科技创新团队项目一项；主持湖
3、北省教育厅科研项目一项。指导教师对本项目的支持情况依托课题组现有资源，为项目团队的实验提供设备、试剂、方案设计方法等的支持。项目组主要成员姓名学号专业班级所在学院项目中的分工陈思音生物工程2201班食品与生物科技学院产虾青素微生物培养条件优化吴思怡食品质量与安全2202班食品与生物科技学院产虾青素微生物的分离、鉴定胡小晓生物工程2202班食品与生物科技学院产虾青素微生物的分离、鉴定刘易轩生物工程2201班食品与生物科技学院产虾青素微生物培养条件优化熊丽玲生物工程2201班食品与生物科技学院产虾青素微生物培养条件优化二、立项依据(可加页)(一)研究目的虾青素是氧化性酮式类胡萝卜素的一种，其分子的
4、结构组成由4个异戊二烯单元构成的共规双键长碳链和两端的2个羟基酮六元环连接而成，分子结构中碳碳共辗双键长链及其连接的不饱和羟基酮的存在使虾青素有较强的电子效应，提供给自由基电子并与之发生反应，从而清除自由基并发挥抗氧化的作用。介于虾青素的这些特殊的生物学功能，使得虾青素在食品保健、医药、化妆品、饲料加工等许多行业都备受关注，并得到广泛应用。天然提取和化学合成是虾青素的主要生产方式。相对于化学合成的虾青素来说，天然的虾青素因其良好的生物学性能和安全性，更加受到人们的青睐。尽管如此，美国食品药品管理局已批准人工合成反式结构的虾青素用作水产养殖的添加剂，但是现在市场上虾青素的售价昂贵，其人工合成品单
5、价达2000-2500美元kg,却仍是供不应求。天然虾青素主要来源于虾、蟹等水生生物的甲壳、藻类植物和真菌等多种生物体中。目前从水产品废弃物中提取虾青素普遍存在虾青素含量低、提取费用高的缺点，不能满足大规模商业化生产的需要，于是人们寻求采用微生物发酵法来生产虾青素。雨生红球藻(HaematoCOCCUSPlUViaIiS)积累生产虾青素的速率显著高于另外的藻类，是目前自然界中生产天然虾青素能力最强的生物。除雨生红球藻外，法夫酵母(PhajWIodozyma)被认为是生产天然虾青素的第二大来源。然而，以此生产虾青素存在培养周期长、培养条件复杂、提取分离难度大、产量低等缺陷，且生产工艺很难达到工业
6、生产要求。因此，从自然界中广泛筛选产量高、工艺简单、易于培养和投入大规模生产的虾青素来源生物一直是人们研究和寻找的目标。综上所述，本研究拟采用纯培养法，从小龙虾生长环境中筛选产虾青素的微生物，对虾青素高产分离株进行生理生化研究以及16SrDNA或18SrDNA分子鉴定，并对高产虾青素菌株的培养条件进行优化，以期获得具有较强开发研究和利用价值的优良菌株。(二)研究内容1 .产虾青素细菌的分离、鉴定1)产虾青素细菌的分离在小龙虾养殖虾池附近取水体和土壤样品，设计选择培养基，用稀释涂布法将不同稀释度的样品涂布到不同培养基上，在好氧条件下分离纯化产红色素细菌。选取产红色素菌落，用灭菌接种环挑取少量菌体
7、在营养琼脂平皿上采用连续划线法进行分离纯化得到单菌落。分离纯化出产红色色素的菌种，将培养好的菌种转接到斜面试管中，备用。2)高产虾青素细菌的生理生化及16SrDNA分子鉴定参照伯杰氏细菌鉴定手册和常见细菌系统鉴定手册，对产红色素菌株进行个体形态观察，革兰氏染色和芽抱染色等试验，进行初步鉴定。提取细菌基因组DNA,采用细菌通用引物27F和1492R对高产红色素菌株进行16SrRNA基因的PCR扩增，送至上海桑尼生物科技有限公司测序。2 .产虾青素真菌的分离、鉴定D产虾青素真菌的分离在小龙虾养殖虾池附近取水体和土壤样品，设计选择培养基，用稀释涂布法将不同稀释度的样品涂布到不同培养基上，在好氧条件下
8、分离纯化产红色素真菌。选取产红色素菌落，用灭菌接种环挑取少量菌体在营养琼脂平皿上采用连续划线法进行分离纯化得到单菌落。分离纯化出产红色色素的菌种，将培养好的菌种转接到斜面试管中，备用。2）高产虾青素真菌的生理生化及18SrDNA分子鉴定对所筛选菌株进行表型观察，参照真菌鉴定手册和中国真菌志初步判断所筛选菌株的科属。真菌基因组DNA的提取采用试剂盒，采用引物NSI5。GTAGTCATATGCTTGTCTe-3和NS83,TCCGCAGGTTCACCTACGGA3,对真菌ITStDNA进行PCR扩增。PCR反应体系（50L）:DNA模板1L,上、下游引物（10molL洛1.5L,2T叫Master
9、Mix25L,双蒸水补足到50LPCR反应条件：955min；9530s,5830s,722min,35个循环；727minPCR结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，送至上海桑尼生物科技有限公司测序。3 .虾青素高产菌株的培养条件优化1）种子液制备与摇瓶发酵条件将菌种从斜面培养基中接入装有100mL种子培养基的250mL三角瓶中,28、150rmin振荡培养36h即为种子液。2）碳源及碳源浓度对产虾青素菌株生长及虾青素产量的影响以等量的葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖、麦芽糖替代液体发酵基础培养基的碳源，其他成分不变，采摇瓶发酵条件培养，以菌体干重（生物量）及虾青素产量为指标筛选最佳碳源。
10、3）氮源及氮源浓度对产虾青素菌株生长及虾青素产量的影响以等量的蛋白陈、硝酸钠、硫酸钱、尿素、氯化镂替代液体发酵基础培养基的氮源，其他成分不变，采用摇瓶发酵条件培养，以菌体干重（生物量）及虾青素产量为指标筛选最佳氮源。4）初始PH值对产虾青素菌株生长及虾青素含量的影响以不同PH值（3、4、5、6、7、8）替代液体发酵基础培养基的初始PH值，其他成分不变，采用131所述摇瓶发酵条件培养，以菌体干重（生物量）及虾青素产量为指标，研究不同初始PH值对菌株生长及虾青素产量的影响。5）温度对产虾青素菌株生长及虾青素产量的影响将产虾青素菌株接种于已优化的液体培养基中进行发酵，培养温度分别为18、23、28、
11、33、35、38,pH值为优化得到的最佳值，180r/min震荡培养，其测定菌体干重（生物量）及虾青素产量。6）接种量对产虾青素菌株生长及虾青素含量的影响接种量为:1ml、3ml、5ml、7ml9ml接种量。在接种量不同的基础上，培养时间在最佳培养时间处上下浮动一天。确定最佳接种量。7）响应面优化培养基试验根据Box-Behnken试验中心组合设计原理，对产虾青素菌株培养基体系进行4因素3水平响应面设计，并以虾青素产量为响应值。（三）国、内外研究现状和发展动态虾青素是氧化性酮式类胡萝卜素的一种，分子结构中碳-碳共加双键长链及其连接的不饱和-羟基酮的存在使虾青素有较强的电子效应，提供给自由基电子
12、并与之发生反应，从而清除自由基并发挥抗氧化的作用。虾青素作为一种强的抗氧化剂具有抗氧化、抑制肿瘤、增强免疫力等生物学功能。虾青素的抗氧化能力强，分别是P-胡萝卜素的10倍和-生育酚的500倍。此外，虾青素能抑制脂质体的过氧化，避免磷脂酰胆碱脂质被破坏，保护生物体内蛋白质和DNA不受自由基的损害，使细胞进行有效的代谢活动，维持机体的正常功能。另有研究表明，虾青素的使用有利于动物体内过氧氢化酶蛋白的表达，提高超氧化岐化酶的生物活性，从而使这些蛋白在体内能更好的发挥抗氧化作用。Zhang等研究发现，虾青素间接激活过受体Y（PPAR）阻碍白血病K562细胞的增殖和生长，对癌细胞活性的抑制作用和诱导癌细
13、胞调亡的能力与虾青素呈剂量和时间依赖性。SOng等发现虾青素干预大鼠肝癌CBRH-7919细胞的JAK1/STAT3信号传导途径引起线粒体膜的损伤，诱导肝癌细胞的调亡。虾青素作为光保护剂可减弱紫外线对皮肤的伤害，抑制腐胺、精胺等游离多胺致癌物的生成，使皮肤癌的发病率降低。大量研究指出，虾青素能促使抗体的产生，增强生物机体局部和全身的免疫功能。单线态氧催化产生的大量自由基对机体巨噬细胞的细胞膜结构造成损伤，使巨噬细胞的吞噬效率降低，机体的生物功能发生紊乱，降低机体免疫力。虾青素具有超强的清除自由基和淬灭活性氧的功能，可减少过氧化反应对生物体造成的损伤，增强免疫力。虾青素能提高T细胞和B细胞的活性
14、，吞噬外源性侵入的病原体，增加自然杀伤细胞和嗜中性白细胞的数目，增强生物体的免疫调节功能。介于虾青素的这些特殊的生物学功能，使得虾青素在食品保健、医药、化妆品、饲料加工等许多行业都备受关注，并得到广泛应用刀。天然提取和化学合成是虾青素的主要生产方式。相对于化学合成的虾青素来说，天然的虾青素因其良好的生物学性能和安全性，更加受到人们的青睐。天然虾青素主要来源于虾、蟹等水生生物的甲壳、藻类植物和真菌等多种生物体中。目前从水产品废弃物中提取虾青素普遍存在虾青素含量低、提取费用高的缺点，不能满足大规模商业化生产的需要，于是人们寻求采用微生物发酵法来生产虾青素。雨生红球藻（HaematOCoCCMSPI
15、IMaliS）积累生产虾青素的速率显著高于另外的藻类，对虾青素的积累量能够达到自身干重的4%电叫是目前自然界中生产天然虾青素能力最强的生物。除雨生红球藻外，法夫酵母被认为是生产天然虾青素的第二大来源口川。然而，以此生产虾青素存在培养周期长、培养条件复杂、提取分离难度大、产量低等缺陷，且生产工艺很难达到工业生产要求。因此，从自然界中广泛筛选产量高、工艺简单、易于培养和投入大规模生产的虾青素来源生物一直是人们研究和寻找的目标。克氏原螯虾(尸wcambowsc/oM),俗称小龙虾，属!科(Cambaridae)、原螯虾属(RcmzmWS)动物I。上个世纪20年代，小龙虾由日本引入我国，到70年代，小
16、龙虾养殖产业开始飞速发展，逐渐从简单的养殖加工发展成为集育苗、养殖、加工、销售，以及餐饮、休闲旅游和文化等为一体的综合性产业。小龙虾属于杂食动物，在饮食习性上，小鱼、小虾、浮游生物、底栖生物、藻类都可以作为它的食物，小龙虾在河底比较习惯吃泥。有研究表明小龙虾机体虾青素含量跟其抵御外界恶劣环境的能力呈正相关，其体内虾青素含量越高，抵御外界恶劣环境的能力越强。克氏原鳌虾自身并不能合成虾青素，主要是通过食物链获取虾青素，并在体内不断积累，产生超强的抗氧化能力，因此，在小龙虾生长环境中有望筛选到高产虾青素的优良菌株，服务于虾青素的工业生产及需要。参考文献：张晓娜，惠伯棣，裴凌鹏等.功能因子虾青素研究概
17、况J.中国食品添加齐J,2017,8:208-214.2JacobssonLS,YuanXM,ZiedenB,etal.Effectsofa-tocopherolandastaxanthinonLDLoxidationandatherosclerosisinWHHLrabbitsJ.Atherosclerosis,2014,173(2):231-237.3杨艳，周宇红，徐海滨等.虾青素抗氧化作用动物实验研究J.现代预防医学,2009,36(13):2432-2433.4ZhangX,ZhaoW,HuL,etal.Carotenoidsinhibitproliferationandregulat
18、eexpressionofperoxisomeproliferators-activatedreceptorgamma(PPAR)inK562cancercellsJ.ArchivesOfbiochemistryandbiophysics,2011,512(1):96-106.5SongX,WangM,ZhangL,etal.ChangesincellUltratructureandinhibitionofJAK1STAT3signalingpathwayinCBRH-7919cellswithastaxanthinJ.Toxicologymechanismsandmethods,2012,2
19、2(9):679-686.6周庆新，刘婷婷，杨鲁.虾青素的来源、生物功效及吸收代谢研究进展J食品研究与开发,2017,38(16):214-219.7AnarjanN,TanCP.DevelopingathreecomponentstabilizersystemforproducingastaxanthinnanodispersionslJ.FoodHydrocolloids,2013,30(1):437-447.雷凤爱.雨生红球藻中虾青素的分离纯化及异构体的分析研究D.内蒙古工业大学,2009.9罗卿心，刘晓娟，曹庸等.雨生红球藻中虾青素的分离纯化和手性检测J食品科技,2015,40(1):
20、253-257.10孙伟红，林洪，翟毓秀.红法夫酵母中虾青素的分离纯化和结构鉴定J.食品科学,2014,35(11):79-82.11华晓曼，王心哲，南博等.红法夫酵母发酵生产虾青素提取工艺优化J.食品工业，2017,38(3):56-58.12蹇华丽，宋光均，陈敏纯等CHU-R菌株虾青素稳定性及抗氧化活性研究J.中国食品添加剂,2014(2):114-119.13何亚丁，华雪铭，赵朝阳，等.克氏原螯虾的脂肪需求量及饲料中脂肪与糖类适宜比例的研究J.动物营养学报,2013（05）:1017-1024.（四）创新点与项目特色D分离到产虾青素的细菌、真菌多株，并对菌株进行生理生化和分子鉴定。2）对
21、高产虾青素微生物的培养条件进行研究，以期获得具有较强开发研究和利用价值的优良菌株，为虾青素工业化生产提供理论参考。（五）技术路线、拟解决的问题及预期成果技术路线：纯种分离、产 虾青素菌株的 鉴定采用连续划线法 进行纯种分离素的鉴养化 青物、培优 虾生离及件 产微分定条对虾青素高产菌 株进行生理生化 和分子鉴定种子液制 备与摇瓶 发酵条件虾青素高产菌株的培养条件优化发酵条件 优化温度碳源及碳 源浓度拟解决问题：1）从小龙虾生长环境中筛选到产虾青素的细菌、真菌多株，解决工业生产中产虾青素微生物资源不足的问题。2）对高产虾青素微生物的培养条件进行研究，优化发酵工艺，为工业化生产提供指导。预期成果：1
22、）分离到产虾青素的细菌、真菌多株，并对菌株进行生理生化和分子鉴定。2）对高产虾青素微生物的培养条件进行研究，以期获得具有较强开发研究和利用价值的优良菌株。（六）项目研究进度安排第一阶段（2023年5月-6月）：查阅文献，准备实验。第二阶段（2023年9月-2023年11月）：产虾青素细菌的分离、鉴定。第三阶段（2024年11月中旬-2024年2月）：产虾青素真菌的分离、鉴定。第四阶段（2024年3月-2024年6月）：虾青素高产菌株的培养条件优化。第五阶段（2024年9月-2024年12月）：数据处理，撰写论文。（七）已有基础1 .与本项目有关的研究积累和已取得的成绩课题组成员热爱实验室工作，
23、对科学实验充满热情，对本课题也有较深的认识，已熟练掌握相关微生物操作技术，着手产虾青素微生物的筛选工作，在先前的研究中，己从小龙虾壳中提取虾青素，并对虾青素性质进行了研究，为后期实验奠定了良好的基础。2 .巳具备的条件，尚缺少的条件及解决方法目前，课题组已经能够熟练掌握相关实验技术，对后期实验也有了充足的准备。学院实验条件基本能够满足实验要求。三、经费预算开支科目预算经费（元）主要用途阶段下达经费计划（元）前半阶段后半阶段预算经费总额50001.业务费2500论文发表2500（1）计算、分析、测试费（2）能源动力费（3）会议、差旅费（4）文献检索费（5）论文出版费2500版面费25002.仪器设备购置费3.实验装置试制费1000主要试剂10004.材料费1500耗材购置1500四、指导教师意见本项目拟从小龙虾肠道中筛选产虾青素细菌和真菌的分离，对筛选到的菌株进行生理生化和分子生物学鉴定，并对虾青素高产菌株的培养条件进行响应面优化，具有一定的创新性和应用价值，为虾青素工业化生产提供理论参考。同意申报。导师（签章）：五、院系大学生创新创业训练计划专家组意见专家组组长（签章）：年月日六、学校大学生创新创业训练计划专家组意见负责人（签章）:七、大学生创新创业训练计划领导小组审批意见负责人（签章）：年月日
