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1、第四节 离子交换色谱,1离子交换层析的原理 离子交换层析(Ion exchange chromatography，IEC)是利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的不同而发生差速迁移，从而实现溶质分离的洗脱层析法。,阴离子交换基：DEAE(二乙胺乙基，通用范围：pH8.6），QAB(季铵乙基）；阳离子交换基：CM(羧甲基，适用范围pH4)，P(磷酸基)和SP(磺丙基)。各种凝胶过滤介质键合上述离于交换基，即可制备相应的离子交换剂。常用于制备离子交换剂的介质有Sephadex、Sepharose、TSKget PW、Toyopearl、Bio-GelA和纤维素等。,原
2、理:根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。,离子交换剂分离蛋白质的过程,平衡,吸附,去吸附,分离结束,再生,+,低盐,高盐,利用不同盐浓度将不同蛋白质洗脱下來,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Ion-exchange chromatography,2离子交换层析的操作 离子交换层析的装置主要包括蠕动泵、离子交换层析柱、紫外检测器及部分收集器等。进行离子交换层析时，先将树脂用展开剂处理，使树脂层析剂转变成展开剂离子的型式；然后将溶解在少量溶剂（通常为展开剂）中的试样
3、加到层析柱的上部，再通入展开剂展开，流出液分步收集，测定其含量。在分离制备中，根据检测结果，分段合并各步收集液，并进行浓缩提取。,IEC操作很少采用恒定洗脱法，而多采用：流动相离子强度线性增大的线性梯度洗脱法(1inear gradient e1ution)或离子强度阶跃增大的逐次洗脱法(step wise elution)。,在线性梯度洗脱和逐次洗脱过程中，IEC柱内溶质区带后部的离子强度高于前部，因此区带后部的移动速度高于前部，溶质在洗脱过程中得到浓缩。GFC之外的层析操作多采用线性梯度洗脱法或逐次洗脱法，只是流动相组成的变化情况各不相同。,线性梯度洗脱法的优点是流动相离子强度(盐浓度)连
4、续增大，缺点是需要特殊的调配浓度梯度的设备。逐次洗脱法的优点是利用切换不同盐浓度的流动相溶液进行洗脱，不需要特殊梯度设备，操作简便。缺点是因为流动相浓度不连续变化，容易出现干扰峰。此外，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象，因此洗脱操作参数(如盐浓度，体积)的设计较困难。,综合上述两种洗脱法的特点，在实际层析操作中，如果料液组成未知，一般应首先采用线性梯度洗脱法，确定各种组分的分配特性以及层析操作的条件。选择合适的离子交换剂是操作关键，另外离子交换层析缓冲液的选择也很重要。溶解样品的初始缓冲液离子强度要低，层析展开用的洗脱剂离子强度可升高。使用梯度洗脱时，离子强度逐渐增加。阳离子交换剂的洗脱pH由低
5、到高，阴离子交换剂的洗脱pH由高到低。新的离子交换剂在初次使用前，常需预处理，离子交换剂使用过后，要再生处理。,胶体再生 蛋白质全部溶出后，交換介質要经过再生(regeneration)后，才能再次使用。(2)以12 M NaCl即可洗去杂蛋白，彻底清洗可用0.1 M NaOH洗；阴离子子交換介质可用1 M醋酸纳(pH 3.0)洗1.5倍体积；再以缓冲溶液平衡完全，才能再使用。(3)可测出液的pH，是否与加入的缓冲液一样。也可把膠体取出，在燒杯或斗中澈底清洗。大多数失败是因于再生！,3 离子交换层析的应用及特点 如果说GFC主要用于初步纯化和中后期的脱盐，则IEC是蛋白质、肽和核酸等生物产物的
6、主要纯化手段。这主要是由于IEC基于离于交换的原理分离纯化生物产物，不仅具有通用性而且选择性远高于GFC。,激素多肽的IEC分离 E coli RNA的IEC分离,归纳而言，IEC具有如下的特点：料液处理量大，具有浓缩作用，可在较高流速下操作；应用范围广泛，优化操作条件可大幅度提高分离的选择性，所需柱长较短；产品回收率高；商品化的离子交换剂种类多，选择余地大，价格也远低于亲和吸附剂。,但是，IEC的操作变量远多于GFC，影响分离效果的因素非常复杂。这种复杂性给目标产物的选择性高度纯化带来了机遇，同时也增加了过程设计和规模放大的难度。小型层析柱的实验数据一般不能直接用于规模(包括柱体积和处理量)
7、放大，必须实施必要的探索性实验。,离子交换是可逆的等当量交换反应。传统的离子交换应用时采用固定床实现的，在交换过程中树脂床将分为三段，即饱和区、活性区（传质区）和新鲜树脂区。随着交换进行，传质区不断下移直至底部交换完全。整个过程只有传质区处于工作状态，饱和区和新鲜树脂区闲置，因此树脂利用率低。为了提高树脂利用率，把传质区进行抽象分割成几个小单元，一旦上面的小单元饱和后就移出来进行洗水及再生操作，处理用的新鲜树脂单元又回到传质区底部循环使用，这样大大提高树脂的利用率。,连续离交,为了能够实现树脂单元自动高效的运作，把树脂柱小单元放到一个转盘上，通过转盘的转动来实现切换，而物料通过一个自动旋转分配
8、法控制，把树脂柱分成交换、水洗、再生、漂洗等功能区域，当树脂单元到达指定区域就执行相应的工艺过程，这样可以实现每个过程独立进行，而整体工艺成连续运行,一、疏水性相互作用层析概念 疏水性相互作用层析(Hydrophobic interaction chromatography，HIC)是利用表面偶联弱疏水性基团(疏水性配基)的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析法。,第五节 疏水性相互作用色谱,二、疏水性相互作用层析原理,组成蛋白质的氨基酸中包括一些疏水性氨基酸基团，如苯丙氨酸，酪氨酸；这些基团大部分处于蛋白质内部，但
9、有部分疏水基团暴露于蛋白质表面。在高离子强度盐溶液中，蛋白质表面的水化层被破坏，更多的疏水部分暴露在外，这些暴露在外的疏水基团与介质上的弱疏水性配基发生疏水性作用，被固定相(疏水性吸附剂)所吸附。被固定相吸附蛋白质在疏水性吸附剂上的分配系数随流动相盐析盐浓度的提高而增大。HIC采用高盐下吸附，低盐下洗脱。,盐浓过高，沉淀不可,原理图示,Mechanism of HIC,三、疏水性吸附剂,常用配基 苯基、短链烷基、烷氨基、聚乙二醇聚醚修饰密度 疏水配基修饰密度一般在1040 umol/ml 疏水性吸附作用与配基的疏水性和配基密度成正比，故配基的修饰密度应根据配基的疏水性而异。,四、影响疏水性吸附
10、的因素,离子强度及种类除离子强度外，离子的种类亦影响蛋白质的疏水性吸附。在高价阴离子的存在下，疏水性吸附作用力较高。HIC分离过程中主要利用硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等盐溶液为流动相，在略低于盐析点的盐浓度下进料，然后逐渐降低流动相离子强度进行洗脱分离。,一般配基修饰密度在（1040）mo1cm3之间。配基修饰密度过小则疏水性吸附作用不足，密度过大则洗脱困难。疏水性配基与亲水性固定相粒子之间的偶联主要利用氨基或醚键结合，形成各种疏水性吸附剂，其中R表示疏水配基。,图中a的末端氨基以及a和b的键合亚氨基显弱碱性，在中性pH范围内带正电荷，因此，这类疏水件吸附剂除疏水性吸附外，还可能存在静电吸附(离子
11、交换)作用。图中c的吸附剂利用醚键结合不引入荷电基团，对蛋白质仅产生疏水性吸附作用。,疏水性吸附剂,破坏水化作用的物质 蛋白质疏水部位的失水有利于疏水性吸附。因此水化能力低的物质容易作洗脱剂。SCN，CIO4和I等半径较大、表面电荷密度低，水化能力差，这类阴离子具有减弱水分子之间相互作用因此，这类阴离子称为离液离子（chaotropic ion）；在离液离子存在下疏水性吸附减弱，蛋白质易于洗脱。盐析作用强的高价阴离子（如SO42，HPO42等）的作用正好相反，称为反离液离子（antichaotropic ion）。除离液离子外，乙二醇和丙三醇等含羟基的物质也具有影响水化的作用，降低蛋白质的疏水
12、性吸附作用，经常用做洗脱促进剂，洗脱时疏水吸附强烈、仅靠降低盐浓度难于洗脱高疏水性蛋白质。,表面活性剂 表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位结合，从而减弱蛋白质的疏水性吸附。根据这一原理，难溶于水的膜蛋白质可添加一定量的表面活性剂使其溶解，利用HIC法进行洗脱分离。但此时选用表面活性剂的种类和浓度应当适宜：浓度过小则膜蛋白不溶解，过大则抑制蛋白质的吸附。温度 失水是吸热过程，即疏水性吸附为吸热过程，因此与一般物质吸附相比，趋势相反，即温度越高，吸附越容易。化作,五疏水性相互作用层析的操作,吸附生物大分子采用柱层析法，装柱和拆柱与其他类型的柱层析法相同。为了使要分离的生物大分子能紧密结合在柱上
13、，选择适当的缓冲液、pH和离子强度，也要考虑温度因素。,为了有效地洗脱吸附剂上的生物大分子，可以用下列的一种或几种方法：改换一种具有较低盐析效应的离子；降低离子强度；减弱洗脱剂的极性，也可加入乙二醇；用含有表面活性剂的洗脱剂；提高洗脱剂的pH。,每次实验结束后，吸附剂需要再生。因为吸附剂中尚留有结合紧密的生物大分子、表面活性剂等。未经再生的疏水吸附剂，其吸附容量将明显降低。一般来说可用蒸馏水、乙醇、正丁醇、乙醇、蒸馏水依次洗涤，装柱，用初始缓冲液平衡吸附剂。吸附剂经再生后可反复使用。,再生,蛋白质的纯化过程中，各种分离技术结合的顺序是很重要的。疏水层析可用在沉淀步骤之后，或与凝胶过滤、离子交换
14、层析结合使用。,操作1）加样：样品溶液中补加适量的盐。2）洗脱：用降低盐浓度的平衡缓冲液洗脱。3）再生：除去固定相吸附的杂质，用水或 8mol/L 脲素溶液。应用 主要用于分离纯化大分子物质。,3 疏水性相互作用层析的应用及特点 HIC主要用于蛋白质类生物大分子的分离纯化。这种方法与IEC的离子交换作用完全不同。它不仅是一种有效的分离纯化手段，而且还可与IEC互补短长，分离纯化利用IEC难以分离的蛋白质。但是，由于疏水性相互作用机理比较复状。吸附剂的选择和洗脱分离条件不易掌握。,六、HIC的特点,HIC可作为IEC的补充工具。可直接分离盐析后的蛋白质疏水性吸附剂种类多，选择余地大可通过调节疏水
15、性配基链长和密度调节HIC的吸附力,属于离子交换的原理，根据两性电解质分子间等电点的差别进行分离纯化的洗脱色谱法，可用于蛋白质、多肽和核酸等生物大分子的分离纯化。色谱聚焦需实验特殊的固定相和流动相，难于应用在大规模分离纯化过程，主要用于生化实验规模的样品制备或成分分析。,第六节 其他色谱,一、色谱聚焦（chromatofocusing),二、反相层析 RPC,反相层析(Reversedphase chromatography，RPC)是利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性(疏水性)的差别进行溶质分离纯化的洗脱层析法。与前述HIC同样，RPC中溶质也通过疏水性
16、相互作用分配于固定相表面，但是RPC固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现强烈的疏水性。因此，必须采用极性有机溶剂（如甲醇、乙氰等）或其水溶液进行溶质的洗脱分离。,RPC主要用于相对分子质量低于5000，特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。由于反相介质表面为强烈疏水性，并且流动相为低极性有机溶剂，生物活性大分子在RPC分离过程中容易变性失活。所以，以回收生物活性蛋白质为目的时，应注意选用适宜的反相介质。,溶质在反相介质上的分配系数取决于溶质的疏水性，一般疏水性越大，分配系数越大。例如，烃类化合物的分配系数与其分子所含碳原子数成正比。与其它层
17、析法一样，当固定相一定时，可通过调节流动相的组成调整溶质的分配系数。流动相的极性越大，溶质的分配系数越大。因此RPC多采用降低流动相极性(水含量)的线性梯度洗脱法。反相介质的商品种类繁多，其中最具代表性的是以硅胶为载体，通过硅烷化反应在硅胶表面缝合非极性分子层制备。硅烷化反应式为：,除硅胶外，高分子聚合物也可作为反相介质的载体，如TSK gel Octodecyl4PW和TSK gel OctadecylNPR(聚丙烯酸酯C18)等。反相介质性能稳定，分离效率高，可分离蛋白质、肽、氨基酸、核酸、脂类、脂肪酸、糖类、植物碱等含有非极性基团的各种物质。RPC作为定量分析手段，广泛应用于科学研究、临
18、床诊断、工业检测和环境保护等各个行业。作为产品纯化制备手段，由于反相介质与其分离的对象相比价格较高，多限于实验室规模的应用，在大规模工业生产中应用较少。,三、羟基磷灰石色谱,羟基磷灰石是一种磷酸钙晶体，一般认为其吸附主要是基于钙离子和磷酸根离子的静电引力，前者起阴离子交换作用，后者起阳离子交换作用。通常以磷酸盐缓冲液为流动相，采用提高盐浓度的线性梯度洗脱法。可用于识别DNA和RNA的单链和双链，分离离子交换层析和疏水性相互作用层析难于分离的蛋白质物系。,四、反相色谱(RPC)-疏水色谱的一种,RPC主要用于分子量低于5000，特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可用于蛋白质等生
19、物大分子的分析和纯化。但由于反相介质表面为强烈疏水性，并且流动相为低极性有机溶剂，生物活性大分子在RPC分离过程中容易变性失活。与HIC的异同 反相层析中溶质亦通过疏水性作用分配于固定相表面；反相层析固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现强烈的疏水性；溶质在反相介质上的分配系数取决于溶质的疏水性，一般疏水性越大，分配系数越大。当固定相一定时，可通过调节流动相的组成调整溶质的分配系数。流动相的极性越大，溶质的分配系数越大。因此RPC多采用降低流动相极性（水含量）的线性梯度洗脱法。,反相介质的商品种类繁多，其中最具代表性的是以硅胶为载体，通过硅烷化反应在硅胶表面键合非极性分子层制备。其中利用C18
20、硅烷化试剂制备的反相介质最多，通称ODS（Octadecyl silica），其次是C8和C4。除硅胶外，高分子聚合物也可作为反相介质的载体，如TSK gel Octadecyl-4PW和TSK gel Octadecyl-NPR（聚丙烯酸酯-C18）等。反相介质性能稳定，分离效率高，可分离肽、氨基酸、核酸、甾类、脂类、脂肪酸、糖类、植物碱等含有非极性基团的各种物质。,五、分配色谱,分配色谱法是靠溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法。载体是惰性、没有吸附能力，能吸留较大量的固定相液体。分配柱色谱法中所用的载体主要有三类：硅胶硅藻土纤维素,六、高速逆流色谱,高速逆流色谱（High
21、speed counter current chromatography，HSCCC）是一种无固相载体的连续液液分配色谱技术，在重力与离心力场的作用下，其固定相被保留于分离柱内，从而避免了固相载体与样品发生化学反应变性或不可逆吸附。该技术的样品回收率高，分辨率高，既适用于微量分析也可用于大规模制备。,TBE 300V型高速逆流色谱示意图,1 金属螯合色谱,首先要制备金属螯合介质：琼脂糖环氧活化后与亚氨二乙酸盐，HN:(CH2COO)2Me偶合，形成带有双羧甲基氨基的琼脂糖。,七、其他保留机制的色谱,Cu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等过渡金属离子可与N、S和O等供电原子（electron
22、donor atom）产生配位键，因此可与蛋白质表面的组氨酸（His）的咪唑基、半胱氨酸（Cys）的巯基和色氨酸（Trp）的吲哚基发生亲和结合作用，其中以His的咪唑基的结合作用最强。除了双羧甲基氨基外，可以作为螯合形成基团的还有：水杨酸基，8-羟基喹啉基，氨基琥珀酸基等。在中性条件下，金属螯合色谱填料能与蛋白质外露的组氨酸上的咪唑基及半胱氨酸上的巯基结合，交换配基。,MCC分离时，必须使金属离子对色谱填料凝胶的亲和力大于对欲分离物质的配位亲和力。金属螯合色谱主要用于要依赖金属或直接与金属作用的蛋白质、肽类、核苷酸、核酸及酶的分离与纯化。常在pH值为68时蛋白质可被吸附，洗脱一般降低pH值、增
23、加离子强度或在缓冲液中加入螯合剂如EDTA等方法进行。,2 共价作用色谱,共价作用色层分离法是根据巯基化合物与色谱填料上二硫键之间的共价化学反应面进行的色谱分离的方法。SH基与SS能组成一组氧化-还原体系。,首先要制备色谱填料。葡聚糖凝胶通过CNBr方法活化后，先后用谷胱甘肽及2,2-吡啶基二硫化合物处理，得到谷胱甘肽型二硫键色谱填料。,凝胶也可通过环氧氯丙烷活化后，再用硫代硫酸盐处理，得到还原型的巯基丙基型凝胶，最后用2,2-吡啶基二硫化合物活化便得到巯基丙基型的二硫健色谱填料。也可用交链聚丙烯酰胺作材料制得带巯芳基的活性色谱填料。,共价作用色谱分离法的操作过程：吸附 蛋白质中的半胱氨酸基，
24、与色谱填料上的二硫键发生共价交换反应，蛋白质被结合到色谱填料上。如果吸附后，柱上有剩余的未反应的巯基吡啶基基团，可用pH值4.0低浓度（4 mmol/L）的二硫苏糖醇，0.1mol/L醋酸钠缓冲液洗涤除去。,洗脱 洗脱可以用L-半胱氨酸，巯基乙醇，谷胱甘肽，以及二硫苏糖醇等巯基化合物，在中性条件下进行。洗脱时，若使用还原力逐次增加的巯基化合物或者逐渐增加巯基化合物的浓度，都可以增加蛋白质的洗脱分辨率，提高选择性。洗脱时，释出的吡啶-2-硫酮是一个发色化合物，在343 nm处检出。,再生过程 洗脱后的色谱填料，需用2,2吡啶基二硫化合物处理再生。对于还原型的巯基丙基琼脂糖还必须在80下回流3小时
25、。二硫键色谱填料价格较贵，再生操作麻烦，目前尚未大规模的应用。但是共价结合具有特异性，牢固并且在适当的操作条件下还可获得较高的收率和纯度，故这种方法在某些领域中，特别是在蛋白质序列分析过程及其结构研究中，有着特殊的作用，甚至还可能成为最方便快速、简单的方法而受到欢迎。,3 亲和层析(Affinity Chromatography,AC),1）定义利用生物大分子与其相应互补体间特异识别能力进行多次差别分离的过程2）特点选择性高、操作条件温和；亲和层析剂制备复杂，种类少,3）、常用的生物亲和关系,酶底物及其类似物、抑制剂、辅助因子抗体抗原（蛋白、病毒、细胞）激素受体蛋白、载体蛋白外源凝激素糖蛋白、
26、多糖、细胞表面受体蛋白核酸互补碱基段、核酸聚合酶、核结合蛋白,4）、亲和层析剂的制备,A 载体（骨架）的选择载体的要求载体骨架高度亲水、惰性具有大量可供活化的化学基团具有较大孔径的网状结构良好的化学、物理、生物稳定性常用的载体多糖类（葡聚糖、琼脂糖、纤维素等）有机聚合物（聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等）混合类（改性硅胶、多糖+树脂等）,B 配基的选择,专一性配基参照生物亲和关系类别性配基酶的辅酶（NAD+、NANP+、ATP等）、外源凝激素（伴刀豆球蛋白A等）,C 配基与载体的结合,载体的活化溴化氰法重氮化法环氧氯丙烷法高碘酸法共价偶联反应,溴化氰法,重氮化法,高碘酸法,环氧氯丙烷法,D 亲和层析剂中
27、“手臂”,“手臂”的种类亲水性（肽链）疏水性（碳链）“手臂”的结合方法类似于配基的共价偶联反应,5）亲和层析分离过程,6）影响因素,离子强度亲和力为静电力为主：离子强度，亲和力为疏水力为主：离子强度，抑制氢键形成的物质pH值温度,1）相对分子质量 对于相对分子质量较低（一般在200以下），挥发性比较好，加热又不易分解的样品，可以选择气相色谱法进行分析。相对分子质量在2002000的化合物，可用液一固吸附、液一派分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于2000的，则可用空间排阻色谱法。2）溶解废 水溶性样品最好用离子交换色谱法，或液液分配色谱法。微溶于水，但在酸或碱存在下能很好电离的化合物，也可用
28、离子交换色谱法；油溶性样品或相对非极性混合物，可用液一固色谱法。3）化学结构 若样品中包含离子型或可离子化的化合物，或者能与离子型化合物相互作用的化合物（例如配位体及有机螫合剂），可首先考虑用离子交换色谱，但空间排阻和液一液分配色谱也都能顺利地应用于离子化合物；异构体的分离可用液固色谱法；具有不同官能团的化合物、同系物可用液一液分配色谱法；对于高分子聚合物，可用空间排阻色谱法。,选择色谱分离方法的主要根据,新固定相的研究固定相和流动相是色谱法的主角，新固定相的研究不断扩展着色谱法的应用领域，如手性固定相使色谱法能够分离和测定手性化合物；反相固定相没有死吸附，可以简单地分离和测定血浆等生物药品。
29、检测方法的研究检测方法也是色谱学研究的热点之一，人们不断更新检测器的灵敏度，使色谱分析能够更灵敏地进行分析。人们还将其他光谱的技术引入色谱，如进行色谱质谱连用、色谱红外光谱连用、色谱紫外连用等，在分离化合物的同时即行测定化合物的结构。色谱检测器的发展还伴随着数据处理技术的发展，检测获得的数据随即进行计算处理，使试验者获得更多信息。,色谱法发展方向,色谱新方法也是色谱研究热点之一。高效毛细管电泳法是目前研究最多的色谱新方法，这种方法没有流动相和固定相的区分，而是依靠外加电场的驱动令带电离子在毛细管中沿电场方向移动，由于离子的带电状况、质量、形态等的差异使不同离子相互分离。高效毛细管电泳法没有HP
30、LC方法中存在的传质阻抗、涡流扩散等降低柱效的因素，纵向扩散也因为毛细管壁的双电层的存在而受到抑制，因而能够达到很高的理论塔板数，有极好的分离效果。,色谱新方法,专家系统是色谱学与信息技术结合的产物，由于应用色谱法进行分析要根据研究内容选择不同的流动相、固定相、预处理方法以及其他条件，因此需要大量的实践经验，色谱专家系统是模拟色谱专家的思维方式为色谱使用者提供帮助的程序，专家系统的知识库中存储了大量色谱专家的实践经验，可以为使用者提供关于色谱柱系统选择、样品处理方式、色谱分离条件选择、定性和定量结果解析等帮助。,专家系统,色谱技术在制备和工业规模上的发展目前仍处于相对早期，每种色谱技术都具有不同的优缺点和特性，因此发展能直接处理含固体物料，吸脱附性能高，能警醒大规模生产等综合特性的连续操作色谱技术一直是人们所期望的。在色谱柱型方面，目前普遍采用的是经典的色谱柱，而毛细管柱非常适合于痕量分析，且fenix速度快，样品消耗少，是未来色谱柱型发展方向之一。,展望,
