转氨酶实验前讨论.ppt

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1、谷丙转氨酶的测定(改良赖氏法),谷-丙转氨酶(ALT),催化丙氨酸与-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸:,金氏法(King法)、穆氏法(Mohun 法)和赖氏法(Reitman-Frankel法)。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全相同。不同之处在于作用时间:King法60min,Mohun法和 Reiman法30min。King法单位定义是:每1ml血清在37条件下与底物作用60 min,生成1mol丙酮酸称为一个单位。Mohun 法单位定义是:每毫升血清在pH=7.4,37条件下与底物作用30 min,每生成2.5微克丙酮酸为1单位。赖氏法没有制定自身的单位定义,而是以实验数据套用速率法的卡

2、门氏单位。1个卡门氏单位的定义是:在温度25,pH7.4,波长340nm,光径1cm的条件下,1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。卡门氏单位不是用物质的量浓度,而是用物质的吸光度表示酶的活性单位的。若将卡门氏单位的定义条件代入国际单位计算公式,即得卡门氏单位与国际单位的换算关系:1卡门氏单位=0.4821 IU/L(25),便可将卡门氏单位兑换成国际单位。,简便,但-酮戊二酸的干扰使得实验设计上对总体思路的彻底达成有一定难度。,还原辅酶I在340nm处有最大光吸收,因此伴随还原辅酶I不断被氧化,340光吸收值随之下降,下降速率和ALT活力成比例,籍此测定ALT活力。,特异性

3、、精确度高,但,实验条件要求高,连续监测(速率)法测定,比色法原理:速率法原理:,两种方法各有很强的优势与不足,而他们测定的是同一个体系,可否巧妙的取长补短?,改原赖氏法的反应温度(40改为37)和底物浓度(改为低浓度)的改良赖氏法,对卡门氏单位的科学套用,使比色法一些缺陷得到了卓有成效的克服,使其结果与速率法较为一致,所测酶活性数据可信度大为提高。,实验改动及数据处理注意:1、以蒸馏水(dH2O)确定722分光光度计的100%T,然后测定所有实验数据。2、数据整理:标准曲线各点所获OD值减去丙酮酸含量为零管的OD值,对应各自丙酮酸含量。3、标准曲线:以丙酮酸含量为横坐标,以上述求差后的OD值为纵坐标,按比色法原理要求作图。4、丙酮酸含量与卡门氏单位的回归分析:以丙酮酸含量和其对应的卡门氏单位,分析两组数据之间的相关性(可作图辅助自己判断),利用计算机求算最佳线性拟合,由R方(决定系数)判断,大于0.999,获得回归方程。5、样品结果计算:由丙酮酸-OD520标准曲线求得丙酮酸含量,带入丙酮酸含量与卡门氏单位线性回归方程,求得对应的卡门氏单位。注意样品各自的稀释倍数。,

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