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1、深部真菌(1-3)-D-葡聚糖快速定量检测,深部真菌感染,深部真菌感染简介,定义:由致病性真菌所引起的人体深部感染，如侵及到皮肤深层和内脏，如肺、粘膜、肌肉、脑、消化道等器官，危害性较大,称为深部真菌感染。类型:目前，深部真菌感染已成为免疫功能低下患者发病和死亡最常见的原因。常见有念珠菌病、孢子丝菌病、隐珠菌病、曲霉病、毛霉菌病、马尔尼菲青霉菌病、组织孢浆菌病以及球孢子、副球孢子菌等临床病症。,黑曲霉,深部真菌感染诱因,诱发因素：(1)慢性消耗性疾病，如恶性肿瘤、糖尿病和尿毒症等，可使机体免疫功能和抵抗力降低；(2)长期使用广谱抗生素，敏感的细菌被抑制，消除了正常菌群中与真菌相拮抗的细菌，使真
2、菌得以大量繁殖。有些抗生素可促进某些真菌的生长，(3)肾上腺皮质激素可抑制炎症反应和纤维细胞增生，并可稳定细胞内溶酶体的膜，阻止其中酶的释放，影响中性粒细胞和巨噬细胞溶解杀灭微生物的作用。,(4)大剂量X线照射、抗肿瘤药物和免疫抑制剂都能抑制骨髓，使中性粒细胞和巨噬细胞减少，机体的免疫功能和抵抗力降低。(5)治疗用长时间静脉插管，留置导尿管和大手术，可引起局部损伤，成为真菌侵入的门户，在机体抵抗力低落时在体内繁殖致病。,深部真菌感染的诱因,免疫功能低下,深部真菌感染,组织局部损伤,菌群平衡,长期使用广谱抗生素,大手术、内脏插管,抗肿瘤药物使用,慢性消耗、免疫缺陷疾病,长期使用肾上腺皮质激素,X
3、-R、抗肿瘤、免疫(-),某些内分泌失调：甲低,深部真菌感染的特点,1.不产生内毒素和外毒素，致病机理不明。2.致病力一般较弱，机体免疫低下时发生。3.感染菌种变化，白念珠菌感染下降。热带念珠菌，近平滑念珠菌，克柔念珠菌，光滑念珠菌等感染增多。4.真菌感染早期症状无特异性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死亡率高，真菌感染病学中写到，真菌院内感染死亡率为90%。,深部真菌感染诊治中的问题,1.深部真菌感染发病率增加。2.误诊率高:1984年1997年，医院深部真菌误诊率30%，美国Muglistom1985年耳真菌病误诊率为90%。3.真菌感染与院内感染关系密切，美国80年代末真菌感染占院
4、内感染的10%。4.危险因素多:年龄，肿瘤，移植，抗生素，激素等。5.抗真菌药物品种少，价格贵，因副作用而难以预防用药，耐药显现多。6.没有指导临床用药的可靠指标。,北京协和医院真菌感染病例分布图,深部真菌感染的临床检测,1.G实验：检测(1-3)-D-葡聚糖的含量，判断是否有真菌感染，耗时短，灵敏度高，特异性强。2.GM实验：曲霉属半乳甘露聚糖抗原检测。判断是否曲霉属真菌感染。对儿童及接受造血干细胞移植患者、ICU患者不适用。3.真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查和真菌核酸检测（PCR技术）用于实验室检测，已成为这一领域研究的热点。,1.直接方法：是组织或渗出物中可分离培养出致病真菌。特
5、点：耗时长,并由于大量广谱抗生素的广泛使用，其培养阳性率也是很低。2.辅助方法：临床表现，免疫学，病理学，影像学检查等。特点：观察期不确定，费时费力，特征性不明显，并对医师的专业水平要求高。,传统检查,非传统检查,深部真菌感染的药物治疗,(1-3)-D-葡聚糖简介,1-3-D-葡聚糖本质及特点,葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中，占其干燥重量的80%-90%。其中(1-3)-D-葡聚糖占真菌壁成分50%以上，是真菌细胞壁上的特有成分，其形式以1-3-糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链，分支状1-6-D葡萄糖残基作为侧链。,(1-3)-D-葡聚糖特性,当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、
6、消化等处理后，(1-3)-D-葡聚糖可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液中含量增高。当真菌在体内含量减少时，机体免疫系统可将其清除。在浅部真菌感染中，(1-3)-D-葡聚糖未被释放出来，故其在体液中的量不增高。,对热极为稳定，高压121并不能使其灭活。在念珠菌和曲霉菌细胞壁中含量较多，对G实验灵敏，而隐球菌中含量较少，则需要较多的试剂才能检出。,(1-3)-D-葡聚糖定量测定,测定葡聚糖可以很快得到结果，指导临床医生采取积极的治疗,及时准确的选用抗真菌药物。动态快速检测，不受血中抗生素和酶等的影响。所有真菌的细胞膜上都含有(1-3)-D葡聚糖，而其他微生物、动物及人的细胞成分和细胞外液都不
7、含这种成分，因此在机体的体液中检测到(1-3)-D葡聚糖是诊断深部真菌感染的有效依据。不能确定菌种，但能肯定是否有真菌感染。指导临床科学合理的使用抗真菌药物。当检测到标本中葡聚糖含量较高时，即刻予以系统治疗，不必等鉴定出种属。,定量测定(1-3)-D-葡聚糖的特点,样品来源：血浆，血清，腹水，尿液，脑脊液,定量测定(1-3)-D-葡聚糖的意义,早期诊断：深部真菌感染增多且复杂，早期症状无特异性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死亡率高。因此对深部真菌感染治疗成败的关键在于早期诊断。快速诊断：真菌感染就医的患者，往往病情严重，传统的微生物分离、培养与鉴定需要时间较长，患者在等待期间有可能病情
8、加重，甚至死亡。指导用药：快速确定真菌感染后，选择好治疗方案,有针对性使用抗真菌类药物。为临床选用副作用小，疗效高，价格适宜的药物提供准确的依据。评价效果：应用抗真菌药物后，定期检测血浆中葡聚糖浓度变化，评价选用药物的有效性。监护病程：监护深部真菌感染易感人群的病发状态。动态观察：易感人群，临床疗效,动态浊度法原理,凝固蛋白原,凝固蛋白,动态浊度法,凝固酶,凝固酶原,活化因子C,因子C,细菌内毒素,因子G,活化因子B,活化因子G,1-3-D-葡聚糖,因子B,全过程2小时内完成，可及时提供结果，指导临床,定量测定(1-3)-D-葡聚糖的原理,不同浓度反应体系引起不同的浊度变化，当透光率达到法线时
9、，该时间的对数（LgTg），与葡聚糖的浓度（LgC），呈直线关系,定量依据,定量测定(1-3)-D-葡聚糖的设备,(国内外现状),国外现状,国内现状,美国、日本等国均已出现专用的(1-3)-D葡聚糖检测仪器及配套的检测试剂盒，而且获得美国FDA及厚生省批准文号，作为一种日常检测项目。美国:ELx808Incubating Microplate Readers日本:Wellreader SK603Toxinometer MT-5500,MB-80微生物动态快速测定系统（金山川公司）首家获得SDA认证普及面广,影响大.国内独创专利产品计算机软件著作权,定量测定(1-3)-D-葡聚糖的设备,MB-8
10、0 微生物快速动态测定系统：主机反应器，数据处理分析软件，计算机，打印机，电子恒温加热仪等。,生产商：北京金山川公司,国外检测仪器及试剂,日本生化学Wellreader SK 603,国外-日本,日本和光MT-5500,-Glucan test Wako,国外-美国,ELx808*Incubating Microplate ReadersGlucatell Kit(13)-D-glucan Detection,定量测定(1-3)-D-葡聚糖的试剂盒,GKT-5M Set动态真菌检测试剂盒：真菌反应主剂（用于各种体液中真菌检测）及样品处理液（样品处理液的目的排除体液中存在的各种测定干扰物质）各5
11、支。,生产商：北京金山川公司,定量测定(1-3)-D-葡聚糖的附件,T01智能恒温仪真菌检测专用真空采血管，采尿杯无热原平底专用试管,生产商：北京金山川公司,MB-80的五大特点,生产商：北京金山川公司,快速-2个小时完成检测动态-动态检测定量-定量检测灵敏-内毒素最低检测量1pg/ml(1-3)-D-葡聚糖最低检测量5pg/ml 肽聚糖(PGN)最低检测量20ng/ml检测不受病人用药影响,MB-80的技术指标,灵敏度：最小检出值5pg/ml精密度：批间CV10%准确性：回收率平均75-125%标准曲线范围：5-9000pg/ml相关系数r0.980检测速度快：2小时内完成,测定(1-3)-
12、D-葡聚糖的参考值,真菌定量检测试剂盒GKT-5M Set(定量)(1-3)-D-葡聚糖临床判断阀值为10pg/ml。检测值判读：10pg/ml以下：健康人值10-20pg/ml间：真菌定植病变观察期20pg/ml以上：深部真菌感染，需采用治疗。敏感性与特异性为100%,使用MB-80的临床评价,取一份真菌性肺炎病人标本，重复测定10次，真菌葡聚糖的CV值为6.7%。用公司提供的真菌葡聚糖标准品，测定5次，取均值然后计算相对误差为21.8%。取真菌葡聚糖的标准品，按照公司提供的检测范围，从5000pg/ml开始做10倍稀释，共稀释5次，进行检测，做直线回归分析，相关系数（r）为0.901。,北
13、京安贞医院感染科用金山川科技发展有限公司生产的MB-80微生物快速动态检测仪进行了初步的性能评价：,使用MB-80的临床评价,北京安贞医院感染科使用金山川公司生产的真菌葡聚糖试剂和日本和光公司生产的试剂，在MB-80微生物动态检测仪上做试剂的比对试验，结果见下表：,使用MB-80的临床评价,关于真菌葡聚糖试剂的比对试验-病人 细菌培养结果 金山川试剂 和光试剂-65/M 白色念珠菌 86.2 84.676/M 热带念珠菌 36.2 33.522/F 毛霉菌 480.9 476.675/M 烟曲霉菌 265.1 235.481/M 热带念珠菌 31.5 36.278/F 光滑念珠菌 54.2 5
14、5.761/M 白色念珠菌 22.4 20.268/F 近平滑念珠菌 8.6 5.6-,使用MB-80的临床评价,正常对照组血浆1-3-D葡聚糖含量为2.832.57 pg/ml；深部真菌感染组为54.0636.13 pg/ml。经t-检验分析，对照组与深部真菌感染组1-3-D葡聚糖平均值差异非常显著（t=7.741,P0.001）。血浆葡聚糖检测可在拟诊早期为临床医生提供是否感染真菌的可靠信息，是一种实用的真菌感染早期诊断方法。,第四军医大学西京医院检验科MB-80微生物快速动态检测仪研究深部真菌感染患者血浆1-3-D葡聚糖检测与临床意义时发现：,-中华医院感染学杂志,2005,15(3):
15、354-355,深部真菌感染的病例分析,患者，男,41岁,因双下肢关节疼痛1月余,发热、咳嗽、痰血10余天于2006年9月12日入院.入院前曾予以青霉素抗感染治疗,无好转,随后出现,体温在39度左右波动,并有咳痰,痰中血丝症状.胸部CT检查,发现左肺阴影。入院后9月18日进行支气管镜检查及作病理活检,显示肺左上方叶管口真菌感染.诊断为侵袭性肺曲菌病.实验室检查:入院当天化验血常规显示白细胞 10.1*109/L(中性粒细胞71%,淋巴细胞18.2%,单核细胞9.3%).血沉加快,C反应蛋白(CRP)和降钙素原均升高.9月14日痰培养结果为阴性.9月22日再一次进行痰培养和血浆(1,3)-葡聚糖
16、检测,培养结果依然为阴性但血浆(1,3)-葡聚糖检测为阳性(1806 pg/ml).治疗：入院后给予哌拉西林/他唑巴坦和西米替丁作抗菌治疗,高热未有好转,随后9月21日给予氟康唑静点,高热好转,体温在37度左右波动,以后继续予以抗真菌治疗,情况逐渐好转,9月30日出院.,金山川为您提供的服务,测定操作步骤,我们每一批试剂盒出厂前经过严格的质量控制，并进行了方法学研究，节省了客户对测定方法学的研究，客户只需要按照我们的操作步骤进行，将结果导入我们提供的软件处理数据即可。若客户需要进行方法学验证，我们提供合格的标准品。我们可为您提供专业的培训。,试剂的注意事项,试剂盒出厂前已经过严格的质量检测,禁
17、止在有效期外使用。试剂盒为体外诊断试剂,应在2-8避光保存,禁止使用于人体。试剂盒在使用前应作仔细检查,出现损坏禁止使用,以免影响测定结果。每次实验应做质控品对照，具体过程参照质控品的使用说明书。实验操作全过程都要避免使用金属用具。,适合服务对象,医院：检验科，微生物室，免疫室，呼吸科，血液科，肿瘤科，烧伤科，器官移植部门，肾内科，ICU病房个地区中心血站，血液中心各地区疾控中心药监部门,我们拥有的客户,血站：青岛、菏泽、潍坊、滨州、株洲、大连、松原、哈尔滨、常州市红十字中心血站，烟台、威海、淄博、德州、东营、长沙、武汉、盘锦、铁岭、抚顺、吉林、白城、遵义、上饶、衢州、安阳市、喀什地区中心血站
18、，江西、贵州省血液中心，西安四军医大学西京医院输血科。医院：北京、天津、上海、江苏、浙江、陕西、四川、山东、广东、辽宁、黑龙江、河北、吉林、福建省50多家三甲医院。,联系我们,总公司:北京金山川科技发展有限公司地址:北京海淀区白石桥路30号邮政编码:100083传真:010-62116278电话:010-80663412网页:mount-免费电话：8008180380,分公司:天津市一瑞生物工程有限公司地址:天津开发区天大科技园C8楼三层邮政编码:300457传真:022-66211293电话:022-66211281/82邮箱：xinxiangmount-,上海办事处：021-26316686,谢谢各位专家 欢迎指导,
