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1、2023/8/2,1,第七节 转录后加工,转录产生的RNA称为原始转录产物或原初转录本，通常要经过进一步加工才能成为有功能的各种RNA。,2023/8/2,2,mRNA的加工,原核生物转录后加工,在原核生物中，mRNA的寿命非常短，大多数半衰期只有几分钟。,原核生物的mRNA不需要进一步加工处理就可以作为翻译的模板。,在最近的研究中发现，原核生物的RNA转录后也有在3端加polyA的现象。尽管人们对这种现象还缺乏了解，但它必定有其存在的意义。,2023/8/2,3,原核生物的rRNA和tRNA比较稳定，半衰期为几个小时。,rRNA的后加工,原核生物中有三种rRNA（5S，16S，23S），其基
2、因rDNA与tRNA的基因tDNA混合排列在一个操纵子（rrn）中。大肠杆菌细胞中有7个rrn操纵子。,RNA酶负责rrn操纵子转录产物的后加工。,RNA酶作用后，产物需要进一步转变才能成为成熟的分子，其作用机制尚不十分清楚。,原核生物的rRNA有哪几种？,2023/8/2,4,2023/8/2,5,2023/8/2,6,tDNA初始转录产物有时包含几个同种tRNA，有时包含几个不同种tRNA，而有些tRNA与rRNA转录在一起。,tRNA的后加工,2023/8/2,7,型tRNA基因含有CCA序列，在CCA序列下游仍有一段序列，需要在酶的作用下切除。,tRNA的基因有两种类型：,原核生物的t
3、RNA基因多为型，少数噬菌体为型。,型tRNA基因没有CCA序列，需要在酶的作用下添加该序列。,2023/8/2,8,RNA酶：负责切开间隔序列。,一系列酶参与tRNA的后加工过程：,tRNA核苷酸转移酶（tRNA nucleotidyl transferase)：以ATP和CTP为前体，催化tRNA的3末端生成CCA。在大肠杆菌中，该酶常用于对CCA末端降解的修复作用。,RNA酶D：是一种核酸外切酶，能逐个切除tRNA 3端多余的核苷酸，使CCA暴露。,RNA酶P：是一种内切酶，能使tRNA产生成熟的5末端。,2023/8/2,9,(RNA酶),RNA酶P,RNA酶D,tRNA核苷酸转移酶,
4、2023/8/2,10,(RNase),2023/8/2,11,真核生物的转录后加工,真核生物的rRNA有4种，即5.8S、18S、28S和5S rRNA。,rRNA的转录后加工,5.8S、18S、28S的基因组成一个转录单位，转录单位呈串联重复排列，由RNA聚合酶负责转录。每个转录单位转录产生47S前体，包含三种rRNA。进一步经过剪切和碱基修饰后产生3种成熟的rRNA。,5S rRNA的基因成簇排列，由RNA聚合酶单独转录。,真核生物rRNA有哪几类？,真核生物rRNA由哪种RNA聚合酶负责转录？,剪切和碱基修饰过程需要一组snoRNA参与。,5S rRNA由哪种酶负责转录？,2023/8
5、/2,12,2023/8/2,13,2023/8/2,14,加工过程中，首先切除3端额外的核苷酸，在tRNA核苷酸转移酶作用下，在3端添加CCA序列，产生成熟的3末端。,tRNA加工,真核生物tRNA基因不含3端CCA序列，前tRNA带有一个16nt 5端前导区，一个14 60nt的内含子，二个额外的3端核苷酸。,酿酒酵母tRNA有272条，其中59为断裂基因，每条只含有一个内含子。其他真核生物类似。,什么是断裂基因？,随后切除内含子，并将两个半个的tRNA分子连接在一起。,2023/8/2,15,2023/8/2,16,核酸内切酶使用测量机制确定切割点，在内含子两端切割，产生一个线性内含子和
6、两个tRNA半分子。两个半分子tRNA具有独特的末端：5端为-OH，3端为环状磷酸基团。,tRNA内含子切除、外显子连接机制：,tRNA剪接经历连续的切割和连接反应。,2023/8/2,17,2023/8/2,18,3端环状磷酸基团在环化磷酸二酯酶作用下打开，产生2-磷酸基团和3-OH。,5端在多核苷酸激酶作用下磷酸化，产生5-磷酸基团。,两个tRNA半分子在腺苷酸合成酶作用下连接成完整的tRNA分子。,磷酸二酯酶、多核苷酸激酶、腺苷酸合成酶分布于同一个蛋白质的不同功能区。,连接点处的2-磷酸基团在磷酸酶作用下去除。,2023/8/2,19,2023/8/2,20,一般情况下，外显子较短（10
7、0-200bp），内含子较长（1kb）。,什么是断裂基因？,从mRNA前提中去除内含子，外显子连接成成熟mRNA的过程称为RNA的剪接（RNA splicing）。,mRNA加工,RNA剪接过程发生在细胞核内，与5端加帽、3端加polyA尾等其他一些修饰同时进行。成熟的mRNA进入细胞质进行翻译。,几乎在所有生物中都发现有断裂基因。在低等真核生物中较少，在高等真核生物中大量存在。,2023/8/2,21,2023/8/2,22,hnRNP,真核生物RNA聚合酶转录产物大小差异很大，表现出不均一性，该转录群体统称为核内不均一RNA。其中主要是前mRNA（pre-mRNA）。,hnRNA合成后很快
8、被蛋白质包裹形成hnRNP。,hnRNP有助于保持hnRNA的单链状态，并辅助各种RNA加工反应。,什么是hnRNA？,2023/8/2,23,2023/8/2,24,5端加帽,RNA链长度超过20-30nt之前，其5端经过化学修饰被加上一个7-甲基鸟苷残基，这种修饰称为帽子结构。催化这一反应的酶是mRNA鸟苷转移酶。,帽子结构中，GMP通过5-5三磷酸桥与RNA链相连。,帽子的功能还不十分清楚，但一定具有重要功能，可能为：,增加mRNA的稳定性；作为核糖体识别mRNA的信号。,2023/8/2,25,根据甲基化程度，帽子结构分为三种类型：,cap0：只有5端7-甲基鸟苷。所有真核生物中都存在
9、。,cap1：除5端7-甲基鸟苷外，还有第二位碱基的核糖2-O位甲基化。除单细胞真核生物外，cap1是一种多数形式。高等真核生物中偶有第二位碱基2-O甲基化后，再次发生N6位甲基化，而且要求第二位碱基是腺嘌呤。,cap2：在cap1基础上，第三位碱基发生核糖2-O甲基化。cap2只占所有加帽mRNA的10-15%。,2023/8/2,26,2023/8/2,27,是否还曾记得？,CTD在RNA加工过程中可能是一个关键点：5端加帽酶（鸟苷酸转移酶）结合在CTD上与剪接相关的蛋白质也结合在CTD上3端聚腺苷酸化装置也结合在CTD上,2023/8/2,28,polyA是由polyA聚合酶（polyA
10、 polymerase，PAP）催化合成，而非由DNA编码。,3端剪切及加尾,多数真核生物mRNA的3末端具有约为200nt长的polyA尾。组蛋白mRNA不具有该特征。,RNA聚合酶没有专一性的终止子序列，转录进行到3端相应位点（聚腺苷酸化位点）后，RNA中的序列成为核酸内切酶切割和随后的多聚腺苷酸化的靶标。,2023/8/2,29,2023/8/2,30,聚腺苷酸化位点（polyadenylation site)由三部分组成：,聚腺苷酸化信号(polyadenylation signal)，即：polyA添加位点上游10-60个碱基处的保守序列5AAUAAA3；切点处的5-YA-3；切点下
11、游富含GU的序列5-GUGUGUG-3。,2023/8/2,31,2023/8/2,32,单一加工复合体同时负责切割和多聚腺苷酸化。,切割因子CF和CF构成内切酶活性区域,专一性因子CPSF识别AAUAAA序列，并指导其他活性的发生,一种刺激因子CstF结合到富含GU区,PAP进行A残基的逐个添加。约添加200个A后，复合物解体。,PABP结合在polyA上，增加mRNA稳定性。,2023/8/2,33,2023/8/2,34,在胚胎发育过程中，非poly（A）化的mRNA作为一种贮存形式，在poly（A）化后开始翻译。,poly（A）的功能：,有助于稳定mRNA分子，因此，与mRNA的寿命相
12、关。但poly（A）的长度与mRNA寿命没有相关性。,mRNA的poly（A）化有利于翻译，为核糖体提供识别mRNA的信号，其具体机制尚不清楚。,2023/8/2,35,mRNA的polyA在分子生物学操作技术中有很大应用价值：,mRNA分离：利用oligo（dT）与载体相连，可以从总RNA中纯化mRNA。,cDNA合成：利用oligo（dT）作为引物，可以反转录合成cDNA。,2023/8/2,36,2023/8/2,37,RNA的剪接,回顾几个基本概念：,断裂基因（interrupted gene）：真核生物的基因含有内含子，称为断裂基因。,内含子（intron）：真核生物的基因序列中某些
13、序列不出现在成熟的mRNA中，这些序列称为内含子。,外显子（exon）：被内含子隔开的出现在成熟mRNA中的序列称为外显子。,RNA剪接（RNA splicing）：一个基因的外显子和内含子共同转录在一条转录产物中，然后内含子被切除，外显子被连接起来形成成熟的RNA，这一过程称为RNA的剪接。,2023/8/2,38,2023/8/2,39,剪接位点,剪接位点（splicing site）：指内含子与外显子交界处的序列。内含子上游的剪接点称为5剪接点或左剪接点或供体位点（donor site），下游方向的剪接点称为3剪接点或右剪接点或受体位点（acceptor site）。,GU-AG规则：内
14、含子两端剪接位点的识别是根据起始点为双核苷酸GU，结束位点为AG来确定的，剪接位点的这种特征常常称为GU-AG规则。,GU-AG规则在真核生物核基因mRNA剪接中具有普遍适用性。,核基因mRNA剪接所需要的序列特征,2023/8/2,40,2023/8/2,41,高等真核生物分支位点没有高度保守性，但在每一位点都有嘧啶或嘌呤的偏好。,分支位点（branch site）,分支位点在3端剪接点的识别中起重要作用。,酵母分支位点是高度保守的，共有序列UACUAAC。,3端附近有一个富含嘧啶的区域,2023/8/2,42,2023/8/2,43,剪接过程,第一次转酯（transesterificati
15、on）反应：分支点序列中A残基上的2羟基攻击内含子5端剪接点处G之前的磷酸二酯键，发生第一次转酯反应，形成一个称为索套的带尾的环状结构，释放出外显子1。,第二次转酯反应：外显子1的3羟基攻击内含子剪接点3AG之后的磷酸二酯键，发生第二次转酯反应，两个外显子连接在一起。,内含子以索套形式释放，最终被降解。,2023/8/2,44,2023/8/2,45,反式剪接,一般情况下，只有同一条RNA分子上的不同外显子通过剪接连接在一起，称为顺式剪接（cis splicing）。,在少数特殊情况下，两个RNA分子的内含子中存在互补序列时可能发生反式剪接（trans splicing），即不同RNA分子的外
16、显子连接在一起。锥虫、秀丽线虫中存在反式剪接。,2023/8/2,46,2023/8/2,47,可变剪接：特定内含子保留成为外显子（内含子保留）；或特定的外显子被剪切，在成熟的mRNA中不保留该外显子（外显子跳读）。,mRNA的可变加工,在许多情况下，真核生物的一个特定前mRNA会产生出一种以上的mRNA，这种加工过程称为mRNA可变加工。,mRNA可变加工的方式：,多启动子选择：由于启动子的选择造成外显子的差异。,可变poly（A）加工：由于存在可被选择利用的poly（A）位点，而产生具有不同3末端的成熟mRNA。,2023/8/2,48,2023/8/2,49,mRNA可变加工实例：,2023/8/2,50,RNA编辑（RNA editing）,原始转录产物的一些序列被更改，产生的mRNA序列与相应基因序列产生较大差异的加工方式。,RNA编辑可发生在个别碱基。例如哺乳动物小肠和肝中载脂蛋白B基因的mRNA编辑。,2023/8/2,51,2023/8/2,52,RNA编辑可由向导RNA指导。,例如：锥虫细胞色素氧化酶基因的RNA编辑。在gRNA指导下，由核酸内切酶、末端尿苷酰转移酶、RNA连接酶组成的复合物催化产生成熟mRNA。,2023/8/2,53,2023/8/2,54,
