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1、第五章 非水酶学,第一节 非水酶学中的反应介质,酶反应在有机介质中进行，已经成为酶工程、酶化工研究的一个新的领域，开辟了一个新的研究方向。由于酶的组成、结构、构象多样化，所以不是所有的酶都可以在有机介质中反应。酶是否适于在有机介质中反应，除与酶性质有关外，还取决于酶-底物、产物-溶剂间的关系问题。这完全需要用实验来决定。,用于酶催化的非水介质包括:含微量水的有机溶剂；与水混溶的有机溶剂和水形成的均一体系；水与有机溶剂形成的两相或多相体系；胶束与反胶束体系；超临界流体；气相。它们不同于标准的水溶液体系。在这些体系中水含量受到不同程度的严格控制，因此又称为非常规介质（nonconventional
2、 media）,第二节 非水介质中酶的结构与性质,一、非水介质中酶的结构 在有机溶剂中，酶分子不能直接溶于其中，它的存在状态有多种形式。主要分为两大类。第一类为固态酶，它包括冷冻干燥的酶粉或固定化酶、结晶酶，它们以固体形式存在有机溶剂中。第二类为可溶解酶，它主要包括水溶性大分子共价修饰酶和非共价修饰的高分子-酶复合物、表面活性剂-酶复合物以及微乳液中的酶等。,酶不溶于疏水性有机溶剂，它在含微量水的有机溶剂中以悬浮状态起催化作用。,二、非水介质中酶的性质 酶在有机溶剂中能够保持其整体结构及活性中心结构的完整，因此它能发挥催化功能。但由于介质的改变，下列方面可能受到影响：,1、热力学稳定性 有机溶
3、剂中酶的热稳定性和储存稳定性都比水溶液中高。例如：猪胰脂肪酶（PPL）在苯中催化酯交换反应时，（1）酶活性随温度升高（2070）而增加，（2）在70连续反应7次（每次96 h）后酶活力仍保持 60，（3）PPL在有机溶剂中 100时的半衰期可达数十小时 在水中100几乎马上失活 PPL的稳定性取决于有机溶剂中水的浓度，1的水，会使PPL的稳定性降低到和水溶液中相同的水平。,2、底物特异性 酶在有机溶剂中对底物的化学结构和立体结构均有严格的选择性。例如：青霉脂肪酶 在正己烷中催化2-辛醇与不同链长的脂肪酸进行酯化反应时，该酶对短链脂肪酸具有较强的特异性，这与它催化甘油三酯水解是相同的。,介质改变
4、时，酶的底物专一性（kcat/Km）和催化效率会发生改变。底物在反应介质与酶活性中心之间分配的变化也是影响酶的底物专一性及其催化效率的因素之一。,3、对映体选择性 酶的对映体选择性是指酶识别外消旋化合物中某种构象对映体的能力。有机溶剂中酶对底物的对映体选择性由于介质的亲（疏）水性的变化而发生改变。疏水性强的有机溶剂中酶的立体选择性差。例如：某些蛋白水解酶在有机溶剂中可以合成D氨基酸的肽，而在水溶液中酶只选择L-氨基酸。,4、位置选择性 有机溶剂中的酶催化还具有位置选择性，即酶能够选择性地催化底物中某个区域的基团发生反应。,5、化学键选择性 化学键的选择性是非水介质中酶催化的一个显著特点。,6、
5、pH记忆 有机溶剂中的酶有些能够“记忆”它冷冻干燥或丙酮沉淀前所在缓冲液中的pH，这种现象为“pH记忆”。实质内容是：（1）酶的反应速度与其冷冻干燥前水溶液的pH密切相关，（2）反应的最适pH接近于水溶液中的最适pH。,二、水,（一）水存在的方式 在有机溶剂中酶的催化活力与反应系统的含水量密切相关。系统中含水量包括：1、与酶粉水合的结合水，（必需水）2、溶于有机溶剂中的自由水，3、固定载体和其他杂质的结合水。与酶结合的水量是影响酶的活力、稳定性以及专一性的决定因素。控制酶结合的水量（必需水）和水在酶分子中的位置是关键。,（二）保证必需水含量 水是保证酶催化反应的必需条件，活性构象是水分子直接或
6、间接由氢键等非共价键相互作用来维持。因此水与酶分子紧密结合的一单层水分子对催化作用非常重要。而其他的水则相对不那么重要(即由有机介质替代的那部分水不那么重要了）。,必需水：是维系酶构象稳定和酶催化活性所必需的那部分最少量的水分子,有时也叫结合水。只要那部分必需水不丢失,其他的大部分水可以由有机溶剂代替。如：有的酶反应即使水只占0.015%，酶仍然有活性，可以进行酶反应,而且反应速度非常快。,胰脂肪酶的反应速度-水含量的关系图,酶结合水的过程分4步：1.首先与酶分子表面的带电基团结合一部分水(0-0.07g/g(水/酶)。2.再与酶分子表面的极性基团g/g(水/酶)。3.再聚集到表面相互作用较弱
7、的部位g/g(水/酶)。4.最后酶分子表面完全水合化，水分子覆盖酶分子表面。,（三）必需水含量问题：因酶分子本身、溶剂系统不同而有所不同。如：脂肪酶有几个水分子,胰凝乳蛋白酶几十个水分子,乙醇脱氢酶、多酚氧化酶有几百个水分子。同一个酶在不同溶剂系统中含水也不同。如：胰凝乳蛋白酶，在甲苯中，含水0.5%，酶活性最高，氯仿等系统中，含水1.0%，酶活性最高。,三、有机溶剂,有机溶剂不但直接或间接地影响酶的活力和稳定性，而且也能够改变酶的特异性（包括底物特异性、立体选择性、前手性选择性等）。通常有机溶剂通过与水、酶、底物和产物的相互作用来影响酶的这些性质。,1、有机溶剂对酶的结合水的影响（1）一些有
8、机溶剂对酶的结合水影响较小，（2）相对亲水性的有机溶剂却能够夺取酶表面的必需水，从而导致酶的失活，（3）增加酶表面的亲水性可以限制酶在有机溶剂中的脱水作用。,2、有机溶剂对酶的影响（1）有机溶剂以通过改变蛋白分子的动态移动性及构象来影响酶的活力。（2）尽管酶在有机溶剂中整体结构以及活性中心的结构都保待完整，但是酶分子本身的动态结构及表面结构却发生了不可忽视的变化。（3）溶剂对酶活性中心的轻微干扰将导致酶的催化活性的改变。（4）酶在不同的有机溶剂中活力差别很大，酶活力和溶剂的属性之间可能存在定量的关系。,3、溶剂对底物和产物的影响（1）溶剂能直接或间接地与底物和产物相互作用，影响酶的活力；（2）
9、溶剂能改变酶分子必需水层中底物或产物的浓度；（3）底物必须渗入必需水层，产物必须移出此水层，才能使反应进行下去；,四、有机溶剂中酶催化活性和选择性的调控,在有机溶剂中酶的催化活性和选择性与反应系统的水含量、有机溶剂的性质、酶的使用形式（固定化酶、游离酶、化学修饰酶等）、所在缓冲液的pH和离子强度等因素密切相关，控制和改变这些因素可以提高有机溶剂中的酶活力，调节酶的选择性。蛋白质工程和抗体酶技术也是改变酶在有机介质中的催化活性、稳定性和选择性的重要手段。,1、必需水（1）必需水是酶在非水介质中进行催化反应所必需的。它直接影响酶的催化活性和选择性。控制(水含量）水活度可使酶的催化效率明显提高。只有
10、在最适含水量时，酶才有高的活力和选择性。例如：脂肪酶催化拆分外消旋2-辛醇的反应当溶剂、酶等其他因素相对不变的条件下，可以用系统含水量衡量水对酶活性的影响。（2）对于生成水的反应（如酯合成和肽合成）体系中水的积累导致酶活力降低，不利于合成反应。向该体系加入分子筛、乙基纤维素等除水剂及时除去反应生成的水，能使酶保持较高活力有利于合成反应的进行。,2、仿水溶剂 具有类似水的高介电常数和形成氢键能力的这种性质的其它溶剂。例如：二甲基甲酰胺（DMF）和乙二醇作为辅助溶剂，部分或全部替代有机溶剂中的辅助溶剂水。,3、溶剂工程 溶剂性质影响酶的活性、酶的底物选择性、位置选择性和立体选择性。通过改变溶剂，可
11、优化到酶的最佳状态。这种技术成为“溶剂工程”。选择溶剂应该注意的事项：选择合适的溶剂使酶达到最佳状态溶剂对底物和产物的溶解性要好，能促进底物和产物的扩散溶剂对反应必须是惰性的溶剂的毒性、成本以及产物从溶剂中分离、纯化等问题。,4、印迹酶 利用酶与配体的相互作用，诱导、改变酶的构象，制备具有结合该配体及其类似物能力的“新酶”，这是修饰改造酶的一种方法。根据酶在有机溶剂中具有”刚性”结构的特点，巧妙地发展了这种修饰酶的技术。酶+配体 沉淀、干燥 去掉配体 印迹酶（在有机相应用，活力高）（在水相中相同）,“D-型印迹酶”“L-型印迹酶”对于“D-型印迹酶”，水含量1mmol/L时酶活力最高，大于此量
12、时，随着水含量的增加酶失去催化“D型”的活力。控制好“印迹酶”在有机溶剂中的最适含水量，可以调节和控制酶催化活性和选择性。,5、化学修饰酶 化学修饰可以改变酶的一些理化性质，有利于酶在有机溶剂中的稳定性。一般认为大多数酶可以在有机介质中反应。但是，操作稳定性差。化学修饰的目的就是要提高酶的稳定性。化学修饰方法很多，常见聚乙二醇（PEG）。如PEG修饰过氧化氢酶，然后在有机介质中活性显著提高。磁性脂肪酶（磁性颗粒外包PEG修饰的脂肪酶），它在有机介质中较稳定，活力也较高，还可在磁场中回收。,例：用谷氨酸、十二醇、葡萄糖酸内酯合成的糖脂后修饰超氧化物歧化酶（SOD）。所得的这种SOD糖脂复合物变成
13、脂溶性的酶，而不是水不溶性的。SOD糖脂复合物在有机介质中活性高大大高于在水中的活性，并且它对温度、pH、蛋白酶水解等的稳定性均高于天然SOD。用聚磷酸酯、脂肪酸等修饰SOD，同样得到了适合于有机介质中进行催化反应的化学修饰酶-SOD。,研究发现化学修饰（采用脱糖基化、PEG修饰等）能够增加酶的表面疏水性，而疏水性的增加正是提高酶在有机介质中的溶解性和活力的重要原因。PEG修饰酶在甲苯中的活性比未修饰酶高16倍。通过酶蛋白甲基化或疏水分子对酶蛋白的修饰，均可提高酶在有机介质中的溶解性、稳定性和活性。,6、固定化酶 固定化有许多好处。固定化酶在有机溶剂中进行酶反应，必定显示其优越性。酶被吸附或者
14、固定在固相载体（水不溶性）上，就可以对抗有机介质对酶的变性能力，提高反应的速度和对热的敏感性。首先，载体通过分配效应剧烈地改变酶所处的微环境中底物和产物的局部浓度。,例：在水溶液中，底物肉桂醇浓度在0.1mmol/L以上可强烈抑制马肝醇脱氢酶活性。现在它在乙酸丁酯中，使用亲水载体固定化酶，底物浓度高达50mmol/L也不会发生抑制作用。例：研究几种不同载体的固定化脂肪酶时发现，疏水性琼脂珠载体的固定化效果最好。固定化后脂肪酶在有机介质中的活性比对应酶粉高46.5。,由于载体上疏水基团的存在，使疏水性底物在疏水作用下分配到载体周围的浓度高于反应介质中的浓度，使酶反应速度提高。,其次，载体影响酶分
15、子上的结合水。亲水性高的载体会从溶剂和酶分子中夺取大量的水，造成酶部分失水而降低酶的活性；亲水性低的载体不足以夺取酶的必需水，能保持它的高酶活性。再次，通过载体与酶之间形成的多点的结合作用，可稳定酶的催化活性构象。例：-胰凝乳蛋白酶与聚丙烯酰胺凝胶共价结合后，在乙醇中的稳定性明显提高，并且对有机溶剂的抗性随酶与载体间共价键数量的增加而增强。,一般来说，载体要选择疏水性基质，目的是为了有利于在有机溶剂中反应。,7、蛋白质工程和抗体酶技术 蛋白质工程技术和抗体酶技术也是改变酶在有机介质中的催化活性、稳定性和选择性的重要手段之一。定位突变 用过渡态类似物诱导，制备了具有酶活性的单克隆抗体“抗体酶”,
16、8、温度 由于酶在有机溶剂中的热稳定性好于水溶液，因此为了提高酶催化速度可以适当提高反应温度。通过温度的调控可以有效地提高产率。,9、pH和离子强度 因为在有机介质中的最适pH与水溶液中的最适pH的酶反应是一样的，所以在进行酶的冻干时，可以在最适pH的缓冲液中冻干，再进行有机系统的反应。这样，可以使酶在有机溶剂中反应的微环境具有溶液酶的最适pH环境。,10、反相胶束中的酶活力的调控 反相胶束中的酶活力与体系组成（pH、离子强度、含水量和表面活性剂及有机溶剂的种类和浓度）密切相关。体系含水量是影响酶活力的重要因素。,第三节 非水介质中酶催化的应用,一、手性化合物的制备 手性化合物是指那些具有旋光
17、性质的化合物，它们的化学组成相同，但是立体结构不同，而成为恰如人的左右手一样的对映体，也称为手性分子。,蝴蝶落在荷兰紫菀蝴蝶的四翅（每侧两个）具有左右对称。,卡特兰(Cattleya labiata)的左右对称注意唇瓣（舌）的上部左右并非完全对称,对映体的存在是自然界中的一种普遍现象。构成生物体的基本物质，如；氨基酸、蛋白质、核酸、糖类等都是手性分子。药物进入生物体内，不同的对映体显示了不同的药理作用。许多药物、生理活性物质、农药和除草剂大部分是手性化合物。手性化合物在功能材料、非线性光电材料、波导材料、导电高分子等方面也具有重要作用。,酶作为生物催化剂可以用于手性化合物的合成和拆分。它具有以
18、下优点：1、具有高对映体选择性，副反应少，产物光学纯度和收得率高。2、酶催化反应条件温和、无环境污染，酶催化手性化合物的合成是将有潜手性的化合物和前体通过酶催化反应转化为单一对映体的手性化合物。,（一）手性药物手性药物是指只含单一对映体的药物。在药物分子的两个形态中，只有一个形态的分子是对疾病有疗效的，而与其对称的分子疗效甚微或不起作用，甚至有毒副作用。普通的药物合成可以获得某种分子两种形态的混合物，手性分子的研究目的就是将药物中不起作用的分子形态剔除，而提高有效成分的纯度。,很多手性药物的对映体具有不同的药理作用,“反应停”事件1961年欧洲出现了孕妇服用外消旋体的“反应停”后产生多起畸胎事
19、件和悲剧。1961-1970年，近九年努力，庭外达成了和解，公司同意支付总额1.1亿德国马克的赔偿金。1992年美国药物和食品管理局（FDA）明确要求一个含手性因素的化学药物，必领说明其二个对映体在体内的不同生理活性、药理作用和药物代谢动力学等情况。,利用手性技术，可以有效地去除药物中不起作用或有害的成分，生产出具有单一定向结构的纯手性药物。手性药物成分更纯，在治疗疾病时毒副作用更小，疗效更好，疗程更短。目前，手性药物的研究已成为国际新药研究的新方向之一，手性技术也成为国际新药研究最前沿的技术。在国际制药界，手性技术已被广泛应用到消化系统疾病、心血管疾病、癌症等领域的药物开发上。2002年全球
20、500种畅销药物中手性化学品药物有289种，占59%。并呈逐年上升趁势。,几种药物的酶法拆分1、-阻断剂类手性药物-阻断剂是用于治疗高血压和心肌梗死类疾病的一种药物，其典型的结构式为：ArOCH2CH(OH)CH2NHR，如：普萘洛尔(propranolol，俗名“心得安”),(1)普萘洛尔的酶法拆分 以对现有的外消旋普萘洛尔生产工艺的中间体（萘氧氯丙醇)进行拆分较为合理。Berinakatti等在有机溶剂中利用PSL（假单胞菌脂肪酶）对其外消旋体水解。得到了（R）-酯的ee（光学纯度）值大于95。,（2）环氧丙醇的酶法拆分环氧丙醇是具有3个碳的手性中间体，可以合成-受体阻断剂类药物、冶疗艾滋
21、病的HIV蛋白酶抑制剂、抗病毒药物、具有生物活性的手性甘油磷脂。Vantol等对其丁酸酯在有机溶剂中与两相体系中用PPL（猪胰脂肪酶）进行了酶促拆分。,2非甾体抗炎剂类手性药物的拆分 非甾体抗炎剂类药物，抑制前列腺素的合成,具有镇痛、解热和抗炎的作用。其活性成分是2-芳基丙酸的衍生物如:萘普生(naproxen，甲氧奈丙酸）布洛芬(ibuprofen，异丁苯丙酸）等。,萘普生的手性拆分现已证实，(S)-萘普生在体内的抗炎活性是(R)型的28倍，现已有直接用化学法合成光学活性的单一对映体萘普生。意大利的Battistel等用固定于载体Amberlite XAD-7上的脂肪酶(CCL)对萘普生的乙
22、氧基乙酯进行酶法水解拆分，使用500 ml的柱式反应器，在连续进行了1 200 h的反应后，得到了18 kg的光学纯(S)-萘普生，且酶活几乎无甚损失。,3、5-羟色胺拮抗物手性药物拆分 5-羟色胺(5-HT)是一种涉及到各种精神病、神经系统紊乱，如焦虑、精神分裂症和抑郁症的一种重要的神经递质。(R)-MDL在体内的活力是(S)-MDL的100倍以上，是以前知名的5-HT拮抗物酮色林的活力的150倍。,在制备MDL过程中用有机溶剂酶法拆分其中一个主要手性中间体。拆分如下：转酯化反应中有选择性生成了(R，R)-酯 残留的为(S，S)-醇,4其它手性药物的酶法拆分叔-亮氨酸(tert-Leu)用于
23、制备一系列抗艾滋病或抗癌药物的重要中间体。Hoechest等将青霉素酰化酶固定在酚醛树脂上，对其衍生物的选择性还原胺化，即可得到所需的光学异构体。,青霉素酰化酶(PA)在工业上被广泛地用于从青霉素制得6APA，作为许多半合成-内酰胺类抗生素的前体。它所体现出的对苯乙酸基有高度选择性的特性，使其不仅能用于催化青霉素的水解，而且能用于催化其它的胺、多肽和醇的反应。,药物的立体化学特性会影响其药效或产生毒性，光学纯手性药物的开发广泛地开展，化学法与酶法均具各自的优势和缺陷，何种方法最佳，则有待研究。酶已在某些手性药物的合成中得到了应用，但对于已知的4 000多种酶而言，这些酶中只有极少数，随着蛋白质
24、工程和工业微生物的不断发展，更为廉价、稳定、适用于多种基质和高度选择性的酶的不断开发，会使酶在手性药物合成中的应用变得更为广阔。,（二）旋光性高分子 聚合物的旋光性来源于两个方面，一方面是单体单元中含有的手性元素，另一方面则是聚合物分子的手性构象，有时又是这两者的共同作用。,利用水解酶在非水介质中可以合成多种手性聚合物。例如:,酶催化可获得较高的立体选择性，而化学催化法则能提供较高的产率，二者结合在合成手性聚合物的应用上，更能获得较大分子量、较高产率的手性聚合物。,（三）其他 酶用于有机合成的范围在不断扩大，有机相中酶催化可完成的反应有氧化、还原、脱氨、羟化、甲基化、异构化、开环、卤化等，其中
25、许多反应类型可应用于拆分反应或不对称合成。例如：1、利用荧光假单孢菌脂肪酶在疏水有机溶剂中进行不对称开环反应,2、利用脂肪酶在无水有机溶剂中催化3-羟基酸甲酯的分子内酯交换反应合成了具有光学活性的内酯。,利用该方法也可以合成大环内酯。,3、拆分许多其他外消旋化合物如：过氧化物可用下列方法拆分：酶促拆分和不对称合成的研究具有广阔的应用前景，促进化学工业和制药工业的高速发展。,二、糖和类固醇的选择性酰化 糖脂作为一种生物功能分子和化工原料具有重要价值。高级脂肪酸的糖脂是一种高效无毒的非离子型的表面活性剂，它广泛应用于食品、医药、发酵及石油化工领域。糖类是多羟基的物质，对其多羟基的位置选择性酯化是有
26、机合成化学中的难题之一。利用生物催化剂的高度选择性，可能会迎刃而解。,例如：将脂肪酸及其底物糖共吸附在亲水性载体硅胶上，进行酶催化乙酸酐和乙酸乙烯酯和单糖反应合成糖脂；利用三酰基葡萄糖苷和三酰基葡萄糖等为底物，在有机相中进行酶促酯交换反应或脱酰基反应制备糖脂,三、功能高分子的合成 酶催化合成可生物降解高分子。可生物降解高分子是指在一定条件下，能被生物体侵蚀或代谢而降解的材料。,可生物降解高分子材料在各个领域的应用前景非常广阔。,传统方法包括天然高分子的改造法、化学合成法等。天然高分子的改造法：通过化学修饰和共聚等方法，对淀粉、纤维素、海藻酸等天然高分子进行改性，制备可生物降解的高分子材料。化学
27、合成法：模拟天然高分子的化学结构，从简单的小分子出发制备分子链上连有酯基、酰胺基、肽基的聚合物。,生物合成法,1、聚酯类可生物降解高分子的酶促合成 聚酯类高分子具有良好的可生物降解性，而且它们的单体易得。,酶促合成法,（1）利用线性单体的缩合反应可以合成具有可生物降解性的聚酯。（2）利用内酯的开环聚合反应合成具有可生物降解性的聚酯。,2、聚糖酯类可生物降解高分子的酶促合成 酶法改性天然多糖主要是在聚酯链上引入糖基，以增强聚合物的生物可降解性能。,3、酶促合成法与化学合成法的联合使用,四、用于生产精细化工产品的酶 目前应用于该领域的酶有脂肪酶、蛋白酶、裂解酶等。1、脂肪酶（1）脂肪酶拆分外消旋丁
28、酸缩水甘油酯，制备（R）-丁酸缩水甘油酯已达到工业水平。（2）Glaxo Wellcome（Stevenage UK）用脂肪酶拆分得到(1S,2S)-反-2甲氧基环已醇，是合成抗生素的重要手性中间体。（3）假单孢菌脂肪酶生产R型和S型的胺已达到每年100t的规模，是合成农用化学品的手性中间体。,2、蛋白酶 目前，只有枯草杆菌蛋白酶和嗜热菌蛋白酶应用于N-酰基氨基酸和氨基酸酯的拆分以及非天然肽的合成。年产数千吨的天冬甜素前体2-Asp-phe-ome的生产3、脱卤酶 假单孢菌脱卤酶用于拆分2-氯丙酸，这是生产除草剂的有效途径，现有生产规模已达年产2000t。,4、裂解酶 裂解酶可以用来催化加成反
29、应产生双键或消去一个基团产生一个不饱和键，以此生产手性化合物。例如：腈（jing）水合酶催化腈与水的加成，产生酰胺。日本的Nitto以每年1000T以上的规模由丙烯腈生产了丙烯酰胺。Lonza也以每年3000T的规模从3腈基吡啶生产了烟酰胺。,5、氧化还原酶 氧化还原酶具有高立体选择性，它们常常用来引入手性和使前手性化合物转化为手性分子。在工业上的主要应用是利用其区域选择性。6、氨基转移酶 D-氨基酸转移酶能够从相应的L-氨基酸产生D-氨基酸。,7、D-乙内酰脲酶/D-N-氨基甲酰酶 代表性例子是每年以数千多吨规模生产D-P-羟苯基甘氨酸。它用于头孢霉素和青霉素的半合成。日本味之素、德国拜耳等公司均用此法生产。,8、有工业应用潜力的生物转化用酶 天然香兰素来自于葡萄糖香草醛，它的年产量仅有20 t，而世界每年需求量为12000t。,D-葡萄糖、D-氨基酸、光学活性醇是许多药物、农药和化工产品的重要中间体。生物转化或生物合成具有很大的优越性。例：利用重组E.coli生物合成D-P-羟基苯丙氨酸,
