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1、革兰氏染色法,河南城建学院环境科学与工程实验中心 环境生物技术实验室,一 目的要求：1、学习并初步掌握革兰氏染色法。2、了解革兰氏染色法的原理极其在细菌分类 鉴定中的重要性。,二 基本原理：革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gran 创立的，基本步骤是：1、初染：结晶紫染色 2、媒染：碘液媒染 3、脱色：乙醇脱色 4、复染：番红复染,经此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色（红色）的细菌为革兰氏阴性菌。,Gram stain of Gram-,Gram stain of Gram+,实验原理：细菌对革兰氏染色的不
2、同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫碘的复合物，增强染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔经缩小，透性降低，从而使结晶紫碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。,Stru
3、cture of a Gram-Negative Cell Wall Structure of a Gram-Positive Cell Wall,三、器材：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，革兰氏染色液，载玻片，显微镜等 四、操作步骤：1、涂片：将大肠杆菌（24h）和金黄色葡萄球菌（24h）分别涂片、干燥、固定。2、染色：（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗（2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖一分钟，水洗（3）脱色：将水甩净，并衬以白背景，用95%乙醇滴洗至刚刚无紫色为止，约2030秒，立即用水冲净乙醇（4）复染：用番红液染1-2分钟，水洗,3、镜检：干燥后，油镜观察。以分散开的细菌颜色为
4、准，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。4、混合制片观察：一载玻片上两种菌混合制片，对比观察。,步骤1：涂片,步骤2：干燥,步骤四 染色,步骤三 固定,crystal violet stain wash with water 结晶紫染色 水洗,Stain with grams iodine solution 碘液复染,Decolorize by adding 95%alcohol 95%酒精脱色,Counterstain with Safranin 沙黄复染,Results of stain染色结果,五 注意事项1）注意涂片不宜过。2）火焰固定温度要适宜。3）注意控制好脱色程度。,六、实验报告：1、结果：列表简述2株细菌的染色观察结果（形状、颜色、革兰氏染色反应）。2、思考题：1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键步骤是什么？2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？3）造成革兰氏染色结果不正确（假阴性或假阳性）的主要原因有哪些？,
