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1、食品加工用水的微生物检测方法介绍,姜英辉,与水质相关的各类标准和检验方法,GB5749-2006，生活饮用水卫生标准 代替（GB5749-85）GB/T 5750-2006 生活饮用水卫生标准检验方法 GB/T 5750.1 总则 GB/T 5750.2 水样的采集和保存 GB/T 5750.3 水质分析质量控制 GB/T 5750.4 感官性状和物理指标 GB/T 5750.5 无机非金属指标 GB/T 5750.6 金属指标 GB/T 5750.7 有机物综合指标 GB/T 5750.8 有机物指标 GB/T 5750.9 农药指标 GB/T 5750.10 消毒副产物指标 GB/T 57
2、50.11 消毒剂指标 GB/T 5750.12 微生物指标 GB/T 5750.13 放射性指标,以上标准于2007年7月1日正式实施，代替1985年的相关标准,与水质相关的各类标准和检验方法,GB85371995，饮用天然矿泉水 GB85381995，饮用天然矿泉水检验方法 GB173231998，瓶装饮用纯净水 GB173241998，瓶装饮用纯净水卫生标准 GB192982003，瓶（桶）装饮用水卫生标准 GB129971991，水质 采样方案设计技术规定 GB129981991，水质 采样技术指导 GB129991991，水质采样，样品的保存和管理技术规定,各类水质的细菌学指标要求,
3、各类水质的细菌学指标要求(续),水样的采集和保存方法 GB/T 5750.2,1 水样的采集方法 范围：适用于生活饮用水和及其水源水样的采集和保存 采样容器：玻璃材质，不透明非活性玻璃容器。容器及塞子、盖子应经灭菌温度并且在此温度下不释放或产生出任何能抑制生物活性、灭活或促进生物生长的化学物质。采样容器的洗涤和灭菌：1 容器洗涤：将容器用自来水和洗涤剂洗涤，并且用自来水彻底冲洗后用质量分数为10的盐酸溶液浸泡过夜，然后依次用自来水，蒸馏水洗净。2 容器灭菌：热力灭菌。干热灭菌要求160，2h；高压蒸汽灭菌121，15min。高压蒸汽灭菌后的容器如不立即使用，应于60将瓶内冷凝水烘干，灭菌后的容
4、器应在2周内使用。,水样的采集和保存方法 GB5750.2,1 水样的采集方法 同一水源，同一时间采集几类检测指标的水样时，应先采集供微生物学指标检测的水样，采样时应直接采集，不得用水样涮洗已灭菌的采样瓶，并避免手指和其他物品对瓶口的污染。在取自来水样时，先用酒精灯将水龙头烧灼消毒，然后把水龙头完全打开，放水几分钟后，再取水样。采取含有余氯的水样时，应在水样瓶未消毒前按每125ml水样加入0.1mg硫代硫酸钠除去残余余氯。,取样体积：0.5L,水样的采集和保存方法,2 水样保存 各种水质的水样，从采集到分析这段时间里，由于物理的、化学的、生物的作用会发生不同程度的变化，这些变化使得进行分析时的
5、样品已不再是采样时的样品，为了使这种变化降低到最小的程度，必须在采样时对样品加以保护。微生物：04避光保存，每125ml水样加入0.1mg硫代硫酸钠除去残余余氯，保存时间4h。,水样的采集和保存方法,水样的采集和保存方法,2.3 水样的过滤和离心 需要进行微生物检测的样品 不能进行过滤和离心,水样的采集和保存方法,3 水样的管理3.1 水样的标签设计 水样采集后，往往根据不同的分析要求，分装成数份，并分别加入保存剂。对每一份样品都应附一张完整的水样标签。水样标签的设计可以根据实际情况，一般包括:采样目的，监测点数目、位置，监测日期，时间，采样人员等。标签应用不退色的墨水填写，并牢固地贴于盛装水
6、样的容器外壁上。,水样的采集和保存方法,3.2 水样的运送 装有水样的容器必须加以妥善的保护和密封，并装在包装箱内固定，以防在运输途中破损，包括材料和运输水样的条件都应严格要求。除了防震、避免日光照射和低温运输外，还要防止新的污染物进入容器和沾污瓶口使水样变质。3.3 实验室对水样的接收 水样送至实验室时，首先要核对水样，验明标签，确切无误时签字验收。如果不能立即进行分析时，则应尽快采取保存措施，并防止水样被污染。,水样中细菌学项目检测方法 GB/T 5750.12,1 菌落总数 1 平皿计数法2 总大肠菌群 1 多管发酵法 2 滤膜法 3 酶底物法3 耐热大肠菌群 1 多管发酵法 2 滤膜法
7、 4大肠埃希氏菌 1 多管发酵法 2 滤膜法 3 酶底物法,菌落总数的检验,方法：平皿计数法范围 此方法规定了生活饮用水及其水源水中细菌总数的测定方法 此方法适用于测定生活饮用水及其水源水中的细菌总数,细菌总数的检验,检验步骤：1 生活饮用水 1.1 以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1ml充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，倾注约15ml已融化并冷却到45左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每次检验对应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。1.2 待冷却凝固后，旋转平皿，使底面向上，置于37恒温箱内培养48h，进行菌落计数，即为水样1ml中的细菌总数
8、。,细菌总数的检验,2 水源水 2.1 以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1ml充分混匀的水样，注入盛有9ml灭菌水的试管中，混匀成1：10稀释液。2.2 吸取1：10稀释液1ml注入盛有9ml灭菌水的试管中，混匀成1：100稀释液。按同法依次稀释成1：1000、1：10000稀释液等备用。吸取不同浓度的稀释液时必须更换吸管。2.3 用灭菌吸管吸取23个适宜浓度的稀释液1ml，分别注入灭菌平皿内。以下操作同生活饮用水的检验步骤。,细菌总数的检验,不同稀释度的选择及报告方法,总大肠菌群的检验,方法：多管发酵法总大肠菌群：指一群在37培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
9、该菌群主要来源于人畜粪便，具有指示菌的一般特征，故以此作为粪便污染指标，评价饮水的卫生质量,总大肠菌群的检验,检验步骤 乳糖发酵试验 1 检验生活饮用水时，取10mL水样接种到10mL双料乳糖蛋白胨培养液中，取1mL水样，接种到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1mL水样注入到9mL灭菌生理盐水中，混匀后吸取1mL(即0.1mL水样)。注入到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度共接种5管。对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接种5份10mL双料培养基，每份接种10mL水样。,总大肠菌群的检验,检验步骤 乳糖发酵试验 2 检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接
10、种1，0.1，0.01mL甚至0.1，0.01，0.001mL，每个稀释度接种5管，每个水样接种15管，接种1mL以下水样时，必须作10倍递增稀释后，取1mL接种。每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌分度吸管。,总大肠菌群的检验,3 将接种管置361培养箱内，培养242h，如所有乳糖蛋白胨培养管都不产气、产酸，则可报告为总大肠菌群阴性。如有产酸产气者，则按下列步骤进行。4 分离培养 将产酸、产气的发酵管，分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于361培养箱内，培养1824h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落：深紫黑色，具有金属光泽的菌落 紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落 淡紫红色，中心较深的菌落 做
11、革兰氏染色，镜检和证实试验。,总大肠菌群的检验,证实试验：经革兰氏染色为阴性无芽孢杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，361培养箱中培养24h2h，有产酸产气者，证实有总大肠菌群存在。结果报告：根据证实为总大肠菌群的管数，查MPN检索表。,总大肠菌群的检验,方法：滤膜法总大肠菌群滤膜法：是指用孔径为0.45m的微孔滤膜过滤水样，将滤膜贴在添加乳糖的选择性培养基上37培养24h，能形成特征菌落的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌以检测水中总大肠菌群的方法。,准备工作：1 滤膜灭菌：将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每次15min，前两次煮沸后需更换水洗涤23次，以除去残留溶剂
12、。2 滤器灭菌：用点燃的酒精棉球灭菌，也可用蒸汽灭菌，121，20min。,过滤水样用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好 滤器，将100mL水样注入滤器中，打开滤器阀门，在-5.07104Pa下抽滤,培养水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入37恒温箱内培养24h2h,结果观察与报告：深紫黑色，具有金属光泽的菌落 紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落 淡紫红色，中心较深的菌落 作革兰氏染色，镜检。经革兰氏染色为
13、阴性无芽孢杆菌，再接种乳糖蛋白胨培养液，37培养24h，有产酸产气者，则判定总大肠菌群阳性。,计算滤膜上生长的总大肠菌群数，报告每100mL水样中的总大肠菌群数（CFU/100mL）100,总大肠菌群菌落数（CFU/100mL）,数出的总大肠菌群菌落数,过滤的水样体积,方法：酶底物法范围 本法可在24h判断水样中是否含有总大肠菌群及含有的总大肠菌群的最可能数（MPN）。本法可同时检测大肠埃希氏菌。,总大肠菌群的检验,耐热大肠菌群,耐热大肠菌群 用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群分开，在44.5 仍然能生长的大肠菌群，称为耐热大肠菌群。,总大肠菌群乳糖发酵试验阳性管 E
14、C培养基，44.5培养24h不产气 阴性产气 转接EMB平板，44.5 培养1824h 典型菌落，阳性未经氯化消毒的水，且仅检耐热大肠菌群，或水源水：水样 接种乳糖蛋白胨培养液，44.5 培养24h不产气 阴性产气 EC培养基，44.5培养24h，判断方法同上面步骤幻灯片 35,耐热大肠菌群滤膜法：是指用孔径为0.45m的微孔滤膜过滤水样，细菌被阻留在膜上，将滤膜贴在添加乳糖的选择性培养基上，44.5培养24h，能形成特征菌落以此来检测水中耐热大肠菌群的方法,检验步骤：准备工作：同总大肠菌群过滤水样：同总大肠菌群培养用灭菌镊子移取滤膜于MFC培养基上，放入44.5恒温箱内培养24h2h。耐热大
15、肠菌群在此培养基上菌落为蓝色，非耐热大肠菌群菌落为灰色至奶油色。对可疑菌落转种EC培养基，44.5培养24h2h，如产气则证实为耐热大肠菌群。,计算被证实的耐热大肠菌群数，报告每100mL水样中的耐热大肠菌群数（CFU/100mL）100,耐热大肠菌群菌落数（CFU/100mL）,所计的总大肠菌群菌落数,过滤的水样体积,大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌多管发酵法是指多管发酵法总大肠菌群阳性，在含有荧光底物的培养基上44.5培养24h产生-葡萄糖醛酸酶，分解荧光底物释放出荧光产物，使培养基在紫外光下产生特征性荧光的细菌，以此来检测水中大肠埃希氏菌的方法。,检验步骤：总大肠菌群乳糖发酵试验阳性管 ECMUG管中，44.5培养24h 366nm波长6W的紫外灯照射产生蓝色荧光 阳性计算EC-MUG的管数，查MPN表耐热大肠菌群2,滤膜法：用滤膜法检测水样后，将总大肠菌群阳性的滤膜在含有荧光底物的培养基上培养，能产生-葡萄糖醛酸酶，分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光。,检验步骤接种：总大肠菌群滤膜上有典型生长菌落 将滤膜转移至NAMUG上，细菌生长面向上，37培养4h。将培养后的平板在暗处用366nm波长6W的紫外灯照射，如果菌落边缘或菌落背面有蓝色荧光产生则表示水样中含有大肠埃希氏菌。记录有蓝色荧光产生的菌落数并报告，格式同总大肠菌群滤膜法。,
