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1、第五章 继代培养,一、细胞脱分化与愈伤组织:培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化。脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性的、松散的细胞团称为愈伤组织。,愈伤组织的特征:愈伤组织细胞大而不规则，高度液泡化、没有次生细胞壁和胞间连丝。愈伤组织从其表面向内5-10个细胞是分生中心，细胞体积明显的小，有胞间连丝和果胶质。这一分生中主是愈伤组织增殖的主要部位。,二、愈伤组织形成的条件:愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类,而是培养条件,其中激素的种类和浓度最为重要.,诱导愈伤组织常用的生长素是2,4-D,IAA 和 NAA.常用
2、的细胞分裂素是KT和6-BA.在禾谷类植物中，多数情况下只用2,4-D就能成功地诱导愈伤组织，但若以NAA代替2,4-D，外植体则只会生根，而不愈伤化。当以烟草茎髓、胡萝卜贮藏根和马铃薯块茎组织作外植体时，诱导愈伤组织则既需要生长素，也需要细胞分裂素。,三、愈伤组织形成的过程,细胞脱分化过程中细胞结构会发生急剧变化。这些变化总体上包括：细胞质显著变浓，大液泡消失，核体积增加并逐渐移位至细胞中央，细胞器增加。液泡蛋白体的出现和质体转变为原质体被认为是细胞脱分化的重要特征。根据愈伤组织形成过程的时空顺序，可分为三个阶段：,第一阶段为诱导期（细胞分裂的准备期）：表现为细胞质增生，出现活跃的原生质流动
3、，贮藏物质淀粉等消失；细胞内核糖体增加并形成大量多聚核糖体；RNA迅速合成和累积。此阶段长短的决定因素：植物种类；同种植物不同生理状。如开始第一次细胞分裂所需时间：菊芋块茎未经贮藏需22h,贮藏后需40h；胡萝卜-96h.,第二阶段为分裂期（细胞从开始分裂到持续分裂的时期）：细胞数目增加、体积变小、核和核仁变大、RNA含量持续上升。从培养外植体的形态变化来看，表现为外层细胞迅速分裂。当细胞体积最小，细胞核和核仁最大，细胞内无大液泡,RNA含量最高时，标志着细胞处于分裂高峰时期。,第三阶段为形成期：外植体细胞经过诱导期和分裂期后形成了无序结构的愈伤组织的时期.生化变化-各种酶活性加强、淀粉的累积
4、、RNA和组蛋白合成速度加快。形成期的特征-细胞形态大小保持相对稳定，体积不再减小，愈伤组织不再增殖。,优良的愈伤组织通常必须具备以下4个特性中的2-3个特性：A 高度的胚性或再分化能力，以便从这些 愈伤组织中得到再生植株。B 容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优 良的悬浮系，并且在需要时能从中分离 出全能性原生质体。,C 旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤 组织建立大规模的愈伤组织无性系。D 经过长期继代保存而不丧失胚性，以便 可能对它们进行各种遗传操作。,四、诱导愈伤组织时通常采用的策略：,A 选择适当的基因型和适当的外植体。B 选择正确的培养基，特别是正确的植物激 素的种类和浓度，以及在需
5、要配合使用生 长素和细胞分裂素时，二者之间正确的配 比。,C 采用某些特殊的理化因素改变愈伤组织诱 导培养基和培养条件。在玉米幼胚愈伤组织培养中，一些研究者通过在培养基中添加5mg/L或10mg/L AgNO3，抑制愈伤组织内乙烯的作用，从而使类型II愈伤组织的频率显著提高。,类型I：结构致密，生长较慢，容易分化成苗，称为保守分裂型.类型II：结构松脆，生长旺盛，色泽鲜艳，增殖很快，称为亢进分裂型.,五、愈伤组织分为3种主要类型：,类型III：结构疏松，生长缓慢，色泽暗淡，称为衰败型.生长素促使细胞进入亢进状态.细胞分裂素促使细胞进入保守状态.还原态氮（氨态氮）促进细胞分裂.硝态氮抑制细胞分裂
6、.,六、继代培养,1、愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养。这个过程收继代。继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。2、通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保存持在不分化的增殖状态。,如果让愈伤组织留在原来的培养基上继续培养而不继代，它们则不可避免地发生分化。,1、种子无菌播种在简单营养培养基（通常不必附加生长调节物质）上可萌发产生无菌实生苗，可提供无菌外植体，这对难以进行表面消毒的植物组织培养意义更大（因为种子相对耐表面消毒）。2、种子培养可将无胚乳种子（如兰花）无菌萌发成苗。,七、以种子作为外植体进行培养有何
7、应用？,3、种子和胚轴培养可诱导胚性愈伤组织。4、种子和胚轴还可以在适当的培养基上诱导腋发育，形成丛生芽。,种子作为外植体的优势：1、易获得数量较多的外植体；2、耐消毒；3、操作简单；4、种子培养通常不受季节限制，如北方冬季难以从野外进行枝条等外植体的采集。,不足之处：1、许多植物种子为天然杂种，不同种子培养产生的后代可能在基因型和表现型上存在较大差异，这对利用种子及实生苗进行微繁有一定影响。2、不少热带亚热带种子为顽拗型种子，耐储时间短，如芒果种子在自然状况下只有8天寿命。,（一）接种方式与生长观察1、一般外植体可将其一半或部分插入培养基中，茎尖接种时应避免插入太多而引起缺氧；2、直生或斜向
8、生长的植物材料离体培养时，应保持自然生长方向接种；有时为了促进侧枝的形成，茎尖接种时也可以水平放置在培养基上；,八、培养过程中出现的问题及其解决办法,3、要定期对培养物进行观察和统计，根据培养物生长情况及时对培养基和培养条件做出调整；4、培养过程中经常会出现污染现象，要及时加以清除；5、在继代培养时一定要仔细检查，避免将污染的材料进行扩大增殖。,（二）外植体褐变 1、有些植物材料在接种后会从伤口处分泌出褐色或黑色色素。这是由于外植体切割后，内部细胞与外界空气直接接触，组织中多酚氧化酶激活，多酚类化合物和单宁被氧化后主生醌类物质的缘故。2、当这些物质扩散到培养基中时，会抑制外植体其他酶的活性，毒
9、害外植体。,3、植物种类或基因型、外植体采集时间、采集部位及生理状态、培养基成分、培养条件、继代培养时间等都影响褐变的发生。4、避免产生褐变的对策：（1）应尽可能接种较大的外植体，采用锋利的解剖刀并使切面垂直（减少伤口面），避免对外植体切割损伤，或采用幼龄材料及分生部位或幼态部位外植体接种。,（2）尽可能在初代培养中降低培养基中无机盐和植物生长调节物质的浓度；（3）避免过高的温度和过强的光照（如采用散射光）；（4）在培养基中培养时间不宜过长，尽可能及时转接到新鲜培养基上，有时为了防止褐变每隔数小时就转接一次；,（5）外植体采集后用流水冲洗30分钟以上，在接种前先将外植体在无菌水中浸泡处理或在无
10、菌水中切割；（6）使用液体培养基；（7）在培养基中加入以下成分：活性炭：加入量为0.2%3.0%聚乙烯吡咯烷酮：PVP,加入量为510 g/L 柠檬酸：加入量为0.05%0.5%芸香苷：加入量为50100mg/L 硫代硫酸钠：20%溶液，加入量为5ml/L,维生素CL-半胱氨酸谷氨酸精氨酸天冬酰氨硫脲,（三）玻璃化苗现象1、苗芽玻璃化是一种异常生理现象，是植物组织培养中出现的半透明状、畸形的试管苗。2、其解剖特点是：（1）整株植物矮小肿胀，呈半透明状。（2）有时发育出在量短而粗的茎，节间很短或几乎没有节间，输导组织虽然可看到，但导管和管胞木质化不完全。,（3）叶片厚而狭长，有时基部较宽，叶片皱
11、缩或纵向卷曲，脆弱易折易碎，叶表缺少角质层或蜡质，或蜡质发育不完全，无功能性气孔。玻璃化叶片不具有栅栏组织，仅有海绵组织。许多木本植物（如苹果、松、李、梨等）和草本植物（如菊花、甜瓜、香石竹等）的组织培养都会遇到玻璃化苗现象。,3、玻璃化现象发生的原因,（1）使用琼脂浓度低的培养基或液体培养基；（2）水势或容器的相对湿度过高；（3）培养基中BA浓度过高、培养基消毒时间过长；（4）采用幼嫩植物材料等。总之，培养基和培养条件不适宜、不平衡是试管苗玻璃化发生的直接原因。,4、降低和减轻玻璃化现象发生可采取的措施,（1）增加琼脂和（或）糖浓度；（2）改善培养容器的气体交换；（3）改善培养基的大量盐类；
12、（4）降低BA水平；（5）增强光照，适当降低温度；（6）避免采用容易产生玻璃化现象的琼脂种类；（7）采用液固两相培养基。,实验六 愈伤组织的继代培养,【目的】（2分）了解愈伤组织继代培养的基本原理，学习愈伤组织继代培养的方法。【原理】（8分）愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养，这个过程收继代。将初代培养所得到的愈伤组织切成小块后接种到新鲜培养上培养即可增殖。,【材料】（2分）水稻种子诱导形成的愈伤组织【实验用品】（3分）1试剂：(1)NAA、琼脂、蔗糖、2,4-D、甘露醇等(2)继代培养基 MS培养基（含2-4，D 0
13、.5mg/L+NAA 0.2mg/L+1%甘露醇+3%蔗糖+0.7%琼脂）2器具：各种接种工具、超净工作台。,【实验步骤】（15分）1、按照要求配制继代培养基；2、培养基和接种用具的灭菌和消毒；3、在酒精灯旁，小心从初代培养瓶中取出愈伤组织，放到灭菌的培养皿中，用手术刀切除胚乳、胚芽和胚根等非愈伤组织成分，并将分离好的愈伤组织接种到继代培养基中，接种完后封好培养瓶口，帖上标签，注明接种日期、外植体名称和培养基成分。4、在培养室中培养，7天后观察愈伤组生长情况。,【结果与分析】（50分）1、记录愈伤组织继代的生长状况；生长状况好的愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。2、记录愈伤
14、组织继代的污染情况；污染率()=(污染的材料数/总接种材料数)1003、若愈伤组织生长状况不好，请分析其可能的原因。若有污染请分析导致污染的原因。,【思考题】（20分）1、愈伤组织继代培养与哪些因素有关?2、组织培养中，怎样尽量避免出现褐变和玻璃化苗？,实验情况总结,生科1班：平均污染率：10.85；平均诱导率：44.96生科2班：平均污染率：2.15；平均诱导率：32.38生科3班：平均污染率：11.54；平均诱导率：41.79,1班：污染情况分析：接种10粒（含10粒）以上人数：26人，零污染人数：18人诱导情况分析：接种10粒（含10粒）以上人数：25人，诱导率超过50%的人数：9人,2班：污染情况分析：接种10粒（含10粒）以上人数：24人，零污染人数：19人诱导情况分析：接种10粒（含10粒）以上人数：24人，诱导率超过50%的人数：3人,3班：污染情况分析：接种10粒（含10粒）以上人数：21人，零污染人数：14人诱导情况分析：接种10粒（含10粒）以上人数：21人，诱导率超过50%的人数：7人,期末成绩评定标准,考勤：10%实验（含操作和实验报告）：60%其中，实验一、二、三各占8%，实验四、五、六各占12%。期末考查：30%,
