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1、第二章 分子克隆单元操作,2.2,2.3,2.1,克隆载体,DNA的体外重组（切与接）,目的基因的克隆,2.4,转化与扩增（转与增）,转化子的筛选与重组子的鉴定（检）,2.5,基因工程的操作过程,切,接,转,增,检,一、用于基因转移的受体（宿主）二、转化与扩增,2.3 转化与扩增,一、用于基因转移的受体（宿主）,分子克隆用宿主应具备的条件各种基因工程受体（宿主）的特性实验室常用的基因工程受体,1、分子克隆用宿主应具备的条件,限制性缺陷型,外切酶和内切酶活性缺陷（hsdR-）,重组整合缺陷型,用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-，recB-，recC-）,具有较高的转化效率,具有与载体选
2、择标记互补的表型,感染寄生缺陷型,防止重组细菌扩散污染，生物武器除外,野生型细菌一般不能作为受体细胞，需要进行改造,基因工程主要宿主系统,原核细胞(Prokaryotic),真菌（Fungus),昆虫(Baculovirus),高等真核细胞（Eukaryotic),人（基因治疗）,动、植物（基因农场）,2、各种基因工程受体（宿主）的特性,1）大肠杆菌,遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定。,适用于外源DNA的扩增和克隆、基因文库的构建和外源基因的高效表达，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌。,产生结构复杂、种类繁多的内毒素。,各种基因工程受体的特性,2）枯草芽孢杆
3、菌,遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素,适用于重组蛋白与多肽、特别是微生物来源的酶的高效分泌表达，。,遗传欠稳定，载体受体系统欠完备,各种基因工程受体的特性,3）链霉菌,抗生素的主要生产者，相对操作简便，不产内毒素,主要用于抗生素生产菌株的改良,遗传不稳定，生长相对缓慢,各种基因工程受体的特性,4）酵母菌,具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定,适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌,内源性蛋白产物种类繁多且含量高
4、,各种基因工程受体的特性,5）昆虫细胞（家蚕，杆状病毒表达系统）,具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定,适用于真核生物基因的高效表达,DNA重组操作系统欠完善,各种基因工程受体的特性,6）哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO）,与人的亲缘关系近，表达系统完善，具有合适的糖基化修饰系统,适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体,细胞培养条件苛刻，生长缓慢,各种基因工程受体的特性,7）植物细胞（拟南芥菜、烟叶）,农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用,适用
5、于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良,遗传操作繁琐,3、实验室常用的基因工程受体（宿主）,大肠杆菌,用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、DH5、JM101（Aps、Tcs、Cms）用于接受l-DNA：LE392、ED8654,真菌,哺乳动物细胞 CHO,毕赤酵母、汉森酵母、,啤酒酵母,酵母菌：,丝状真菌：黑曲霉、青霉,二、转化和扩增（转与增）,转化的原理与技术,转化率,转化细胞的扩增,几个基本概念,感受态（compentent)：受体(宿主）细胞经过一些理化或生物学方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性的改变，成为能允许外源DNA进入的一种生理状态
6、。感受态细胞（compentent cell),转化（transformation)：外源DNA导入特定受体（宿主）细胞，并使之繁殖和表达的操作。,转化子（transformant)：经转化而带有外源DNA的受体（宿主）细胞。,重组子（recombinant)：含有重组DNA的转化子。相对于仅含空载体的转化子而言。,1、转化的原理与技术,Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化（Ca2+法）,细菌原生质体的转化（原生质体法）,完整细菌细胞的电穿孔转化（电转化法）,l噬菌体DNA的转染,1）Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化,Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立
7、此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，转化混合物中的DNA与其形成抗Dnase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态即为感受态。,大肠杆菌感受态细胞的制备：,100 ml 菌体培养至OD600=0.5，离心收集菌体,用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心,用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体,冰浴放置12-24小时，备用,收集菌体,大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：,取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组,冰浴放置半小时,在42保温 90秒（热脉冲）,快速将
8、转化细胞转移至冰浴中放置1-2分钟,DNA连接液，混匀,加入1 ml 新鲜培养基，于37培养 1 小时（扩增）,涂在合适的固体培养基平板上进行筛选,2）细菌原生质体的转化,革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子,酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化,不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿
9、应保持无水无去污剂,细菌原生质体的制备：,取0.2-1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加入10-20 ml DNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀,细菌原生质体的转化：,细菌原生质体的再生：,原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素,3）电穿孔转化,将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很
10、大 同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验,4）l噬菌体DNA的转染,感受态细胞的培养：将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基 中培养至OD600=0.5吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30保温10分钟转染裂解：加入20倍体积的新鲜培养基，30培养2小时，直至培养液 中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选,2、转化率,转化率的定义,每微克DNA分子转化宿主菌能获得的转化子数。例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子（6.02X1017/2686X660），也就是说
11、，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞 另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA,转化率的用途,利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模,例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/mg载体，,经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104个,重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？,若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要：,104/107 X 10-2=0.1 mg 载体DNA,考虑到实验系统的
12、重组率为20%，所以实际投入载体应为：,0.1/20%=0.5 mg 载体DNA,转化率的影响因素,载体及DNA重组分子方面：,载体本身的性质：,不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同,载体的空间构象：,质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载,体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的,超螺旋质粒低两个数量级,插入片段的大小：,对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低,转化率的影响因素,受体细胞方面：,受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高,转化方法方面：,受体细胞的预处理：影响最大,供受体
13、的比例：,Ca2+诱导转化 0.1 ml 感受态细胞 50 ng DNA,转化方法：,Ca2+诱导转化 106-107/mg DNA,原生质体转化 109 个原生质体 50 ng DNA,原生质体转化 105-106/mg DNA,l-DNA转染 107-108/mg DNA,电穿孔转化 106-109/mg DNA,3、转化细胞的扩增,扩增操作,转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：Ca2+诱导转化后的37培养一个小时 原生质体转化后的再生过程 l噬菌体转染后的30培养等，均属扩增操作,扩增操作的目的,增殖转化细胞，使得有足够数量
14、的转化细胞用于筛选程序,使载体分子上的标记基因扩增和表达，便于筛选,表达外源基因，便于筛选和鉴定,第二章 分子克隆单元操作,2.2,2.3,2.1,克隆载体,DNA的体外重组（切与接）,目的基因的克隆,2.4,转化与扩增（转与增）,转化子的筛选与重组子的鉴定（检）,2.5,基因工程的操作过程,切,接,转,增,检,转化子的筛选和鉴定的必要性,由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子,转化子,重组子,目的重组子,经转化扩增单元操作后的受体细胞总数（包括转化子与非转化子）已达1091010，需要从中选出期望重
15、组子,概念,转化子筛选和鉴定流程,1、筛选选择性平板筛选,转化子,重组子,目的重组子,非转化子,2、重组子初步鉴定显色、PCR、比大小、酶切、分子杂交、生物/免疫学活性,3、重组子确证 DNA序列分析,4、外源基因表达产物检测 仅当外源基因克隆于特定表达载体和宿主中时才需要。常规基因克隆则否。,1、抗药性筛选法,ROP,ROI,Sal I,BamH I,Tc,r,Pvu I,Pst I,Pst I,EcoR I,Cla I,Hind III,Hind II,Bal I,Ap,r,绝大多数载体的抗性标记用于筛选转化子，但pBR322可筛选重组子：,pBR322,4363 bp,ori,可区分转化
16、子与非转化子、重组子与非重组子,将外源DNA片段插在Pst I位点：,非重组子呈 Apr、Tcr,重组子呈 Aps、Tcr,将外源DNA片段插在BamHI位点：,非重组子呈 Apr、Tcr,重组子呈 Apr、Tcs,一、利用载体表型选择,双抗药性标记筛选法的基本操作：如Tc插入失活,先将转化液涂布含有Ap的平板,再将Ap平板上的转化子影印至,含有Ap和Tc的平板上,在Ap平板上生长、但在Ap和Tc,平板上不长的转化子即为,Ap,Ap+Tc,影印,对照挑选,重组子,较为简便的选择方法,背景知识,具体选择过程,2、营养缺陷型筛选法,营养缺陷型筛选法的基本原理：,营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转
17、化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子,氨基酸核苷酸,常见的营养缺陷型筛选标记：,哺乳动物细胞中存在两条dTTP的合成途径：,用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+,用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激,酶基因tk，相应的受体细胞则选择tk-缺陷型,dCDP,dTDP,dTTP,胸腺嘧啶核苷,dTMP,dTDP,dTTP,AP,TK,AP 氨基喋呤,TK 胸腺嘧啶核苷激酶,3、显色筛选法,显色筛选法的基本原理：,显色筛
18、选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等,显色筛选法,蓝白斑筛选法的基本操作：,pUC18,Ap,r,lacZ,ori,Ap+X-gal,重组子（Apr+lacZ-）,将外源基因克隆在pUC18的lacZ标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，淡黄色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落,选择过程,二、DNA电泳检测,1、直接电泳检测法：从转化后的菌体克
19、隆中分离质粒，电泳比较其分子量利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。,2、限制性酶切图谱法,所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能初步鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,全酶解图谱法：,B,B,E,P,4.0 kb,1.0 kb,0.8 kb,区分重组子与非重组子,用BamHI酶切转化子质粒DNA,电泳观察酶解产物片段,重组子：2.7 kb+4.0 kb,非重组子：2.7 kb
20、,如果外源DNA片段也是2.7 kb？最好选用单一切口的酶将质粒线型化，然后通过其长度来鉴定其是否为重组子,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,全酶解图谱法：,S,S,B,P,4.0 kb,1.0 kb,0.8 kb,区分重组子与非重组子,如果外源DNA片段插在pUC18的SphI位点处，原则上也可用SphI酶解鉴定，但这样做很不经济，因为SphI非常昂贵（每100单位50美元）。用HindIII和EcoRI联合酶解同样可以达到目的，但这两种酶的价格只及SphI的1/50,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,全酶解图谱法：,BamHI,BamHI,EcoRI,PstI,4.0 kb,1.0
21、 kb,0.8 kb,区分目的重组子与非目的重组子,用EcoRI酶切转化子质粒DNA,目的重组子：3.0 kb+3.7 kb,或者：1.0 kb+5.7 kb 反向,用PstI酶切转化子质粒DNA,目的重组子：3.2 kb+3.5 kb,或者：0.8 kb+5.9 kb 反向,3、PCR扩增检测法,三、原位杂交法（高通量筛选）,原理：基于分子杂交原理。将转化子筛选平板上的菌落或噬菌斑进行影印至硝酸纤维膜上后，用碱法原位裂解和固定，以放射性、地高辛或生物素荧光素标记的目的基因的同源序列作探针，进行原位分子杂交分析，即可鉴定出对应的阳性重组子。优缺点：可高通量筛选，但操作繁杂、常有假阳性,菌落原位
22、杂交法的基本操作：,影印,用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板,裂解、固定、洗涤,杂交,感光,用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜,用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜,80烘干固定影印薄膜,薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温,用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜,用X光胶片覆盖薄膜感光,杂交探针的制备：,用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：,单链结构（双链DNA可用碱变性）,足够长度（至少12个碱基）,内部不含互补区,探针的制备方法或来源包括：,人工合成,cDNA合成,同源序列,mRNA,探针合成据已知序列合成据已知氨基酸序列合成,在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸,序列，而基因序列未
23、知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其,编码的DNA序列，然后合成探针。,由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时,必须考虑下列问题：,生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针,探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间,探针内部不应出现可能的互补区域,探针等寡聚核苷酸合成,某段连续的氨基酸序列,Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile,所有可能的DNA序列,TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA,C T G G G T T,C,设计的简并探针序列,TGTATGGACGAAATGA,TGTATGGATGAAATGA,TGTATG
24、GATGAGATGA,TGTATGGACGAGATGA,TGCATGGACGAAATGA,TGCATGGATGAAATGA,TGCATGGATGAGATGA,TGCATGGACGAGATGA,须合成8种,探针需要标记,T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）,T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA的5-OH上加磷,5 HO,3 HO,OH 3,OH 5,T4-PNP,Mg2+pppATP（g-32P-ATP）,5 p,3 HO,OH 3,p 5,用于探针的末端同位素标记：,4）依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）,反转录酶的基本用途之一：以RNA为模板合成cDNA链,3AAAAAAAAAAA
25、AAA,5mRNA,反转录酶,Mg2+dNTP,5TTTTTTTTTTTT oligo(dT)12-18,3AAAAAAAAAAAAAA,5mRNA,5TTTTTTTTTTTTTT,3cDNA,缺口平移标记,菌落噬菌斑原位杂交法,杂交探针的标记：ABC荧光标记,GCTTGAGCAGTAACCTG,荧光胺,Biotin 生物素,Avidin,生物素结合蛋白,烷烃连接臂,菌落噬菌斑原位杂交法,杂交探针的标记：ABC显色酶标记,GCTTGAGCAGTAACCTG,显色酶,Biotin 生物素,Avidin 生物素结合蛋白,烷烃连接臂,生色底物,颜色产物,菌落噬菌斑原位杂交法,杂交探针的标记：地高辛标记系统,dUTP-连接臂-甾醇半抗原,digoxigenin DIG,抗体-显色酶交联复合物,
