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1、实时荧光定量PCR原理及应用,上海吉泰生物科技有限公司,裴杰萍,内 容 提 纲,荧光定量PCR原理及应用Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪,常规核酸定量方法,Southern 杂交Northern 杂交原位杂交传统 RT-PCR半定量 PCR,存在的问题 灵敏度准确性特异性时间,实时荧光定量PCR,定义利用荧光信号对PCR反应的过程进行实时监控目的对起始模板进行定量 优点 灵敏,重复性,动态范围宽,高通量原理 C(t)值与起始模板浓度的对数成反比,什么是C(t)值,C(t),Threshold（域值）,C(t)值与起始模板的关系,为什么要引入C(t)值,96 replicat
2、es of B7 gene molecular beacon,利用电泳定量,11,500 counts/5200 counts=2.2 fold difference,实时荧光定量,Ct 18 and Ct 22,2(4 Ct shift)=16 fold difference,如何定量,标 准 曲 线,未 知 样 品 的 C(t)值,定量,常用的荧光试剂,SYBR Green ITMTaqMan/TaqMan-MGBMolecular Beacons MGB EclipseTM Probes Lux primersScorpionsTM AmplifluorQ-ZymeOthers.,dsD
3、NA Detection,Target-specific Detection,ssDNA=free dye(weak fluorophore),dsDNA=Binds minor groove(intense fluorophore),SYBR Green I(双链DNA结合染料),SYBR Green I Detection,TaqMan 探针,未结合的探针,探针、引物与目的片段结合，FRET,光发射或者以热量形式散失,Donor dye(Reporter),Acceptor dye(Quencher),Light,Energy transfer,Taq,Taqman 三通道实验,Danie
4、l Candotti-Cambridge,UK,荧光定量PCR应用,特异核酸（基因）定性、定量RNA(cDNA)基因表达差异分析基因芯片结果验证DNA病原体定性与定量GMO(遗传改良组织)检测序列特异性等位基因分型,SNP 检测,应用之一：病原体检测与定量,绝对定量（特异基因的拷贝数病原体的多少）标准品（如质粒）：梯度稀释未知样品阴性对照（NTC）,应用之一：病原体检测与定量,1,4,3,2,应用之一：病原体检测与定量,应用之二：基因表达差异分析,相对定量：基因表达量上升或者表达被抑止的倍数两种样品：Calibrator（对照，如正常组织）与Sample（待测样品）两个基因：目的基因与看家基因
5、,应用之二：基因表达差异分析,Calibrator,Gene of Interest目的基因,Ct1,应用之二：基因表达差异分析,基因表达差异2/2,Ct1,Ct2,2,Ct1-Ct2,XnX0(1+E),n,应用之二：基因表达差异分析,RNA抽提,RT,定量PCR,cDNA产物,系列稀释,两个基因的扩增效率,应用之二：基因表达差异分析,4 fold down,3 fold up,应用之二：基因表达差异分析,两条探针分别针对不同等位基因,A,C,G,T,A,C,G,T,应用之三：SNP分析,应用之三：SNP分析,FAM,TET,FAM,TET,应用之三：SNP分析,应用之四：GMO检测,目的：
6、检测食品等中转基因成分的含量,大量的作物被遗传改良来获得一些性状，如：抗除草剂，抗虫，抗病等,应用之四：GMO检测抗除草剂的转基因大豆,广泛使用的除草剂的作用成分是草甘膦。草甘膦是EPSPS（5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶）的竞争抑制物。在草甘膦存在的条件下，EPSPS的活性被抑制。植物被转化了一种耐受草甘膦的EPSPS基因，获得抗性。,检测策略抗性EPSPS基因的量 转基因大豆的量 Lectin基因的量 食品中大豆总量,应用之四：GMO检测,数据处理：C（t）EPSPS-C（t）LectinC（t）%GMO（1+E）,Ct,荧光定量PCR仪的硬件条件,激发光源,热循环加热、制冷,检测设备
7、,荧光定量PCR仪应满足的要求,光源的光谱范围宽广，能激发不同的荧光染料能分开不同荧光素的激发光与发射光波长能检测的灵敏度与动态检测范围准确的温度控制和良好的孔间温度均一性.,荧光定量PCR原理及应用Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪,Stratagenes New Mx3000P!,High Performance Personal Price,Stratagene 公司成立于1984年,致力于发展生命科学领域的创新产品与科技.总部位于美国 La Jolla,California.在欧洲与日本设有分公司.,Stratagene 公司简介,Mx3000P 整体设计,Mx300
8、0P 热循环系统,96 孔样品槽半导体加热制冷温度均一性:+/-0.25C升降温速率:up to 2.5C/sec,热循环系统,半导体加热制冷 resistive and convective heat exchange独特的温度补偿条，整板温度均一性+/-0.25C热盖反应体积10-100ul,Mx3000P 光路系统,PMT,96 well plate,石英卤钨灯,激发光滤镜轮,发射光滤镜轮,扫描式检测,同轴光纤,Mx3000P 光学系统,石英卤钨灯(350-750nm)2 个滤镜轮可选择的滤镜:Filter sets:FAM/SYBR,HEX/JOE/VIC,ROX/Texas Red,
9、Cy5,Alexa350,TET,NED/TAMRA,Cy31 PMT（光电倍增管）检测器350-700nm 发射光检测范围扫描式检测设计,Mx3000P 扫描系统,整板扫描3.5s滤镜轮旋转进行多通道扫描,激发光源的比较,Lasers:光强高,波长范围窄；石英卤钨灯:中等光强,波长范围宽；LED:光强低,波长受限制。,Mx3000P 可用荧光染料,荧光滤镜系统,Mx3000P,四通道设计，避免光谱重叠,Mx3000P 发射光滤镜轮,荧光检测系统的发展,PMT光电倍增管冷CCDCCDPhotodiodes光电二极管,荧光检测系统灵敏度比较示意图,PMT(光电倍增管),冷 CCD,CCD,Pho
10、todiodes光电二极管,PMT与CCD的检测原理,hv,e-,e-,PMT,CCD,CCD与PMT检测区别,无边缘效应,边缘效应,CCD,Mirror,Simultaneous Illumination/Detection,CCD与PMT检测结果均一性对比,Ct vs.Well number(across plate groupings),Mx3000P均一性实验,96 well uniformity run.SYBR Green I detection,96 wellsMean Ct=18.1St.Dev.=0.05C.V.=0.3%Ct Range=0.26 cycles,2-fold
11、 serial dilution(20,000 to 1.2 copies hgDNA.-Actin Mol.Beacon),Std.CurveR2=0.996Slope=-3.183Amplification Efficiency=106.1%,Mx3000P的分辨率与灵敏度检测图。,10 x dynamic range,T7 hydrolysis probe,8 replicates each concentration,10 x dynamic range standard curve,Ct range 6-39,Rsq=0.999,Efficiency=98.6%,Mx3000P检测动
12、态范围检测图（高达十个数量级）。,Mx3000P Multiplex-4 Color Result,FAM,FAMHEX,Mx3000P Multiplex-4 Color Result,FAMHEXROX,Mx3000P 4通道实验结果,FAMHEXROXCy5,Mx3000P Multiplex-4 Color Result,Mx3000P 4通道标准曲线,利用FullVelocity 技术提高PCR运行速度,最新的工程聚合酶 Archaeal(non-Taq)DNA polymerase 同样具有优越的:灵敏度 特异性 可重复性,FullVelocity(40 cycles),TIME
13、SAVED!,传 统 PCR(40 cycles),Mx3000P 软件,易学易用各种数据分析方式：自动分析或者手动分析支持荧光定量PCR的多种应用模式,多种应用模式,软件的结构,PCR板的设定,PCR程序设定,运行时的状态,实时扩增数据,软件自行优化的数据分析,标 准 曲 线,相对定量Results Display,4 fold down,3 fold up,基因分型结果显示,User defined genotypes,color coded populations,and automatic calling on text report,“只读板”实验结果,结果文本显示,Text Rep
14、ort or raw data can be exported to Excel or a text file,Customize report,多种格式输出结果,Text Report,PowerPoint presentation,Any screen shot,Brilliant QRT-PCR and QPCR Reagents,Master mixes and reagent kits for any fluorescent chemistryCompatible with sequence-specific probesSYBR Green kits,DNA Amplificati
15、on,Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix Brilliant SYBR Green QPCR Core Reagent Kit,RNA Amplification,Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix,1-Step,Brilliant SYBR Green QPCR Reagents,DNA Amplification,Brilliant QPCR Core Reagent Kit Brilliant Plus Core Reagent KitBrilliant QPCR Master Mix,2-step RT-PCR
16、,RNA Amplification,Brilliant QRT-PCR Core Reagent Kit,1-StepBrilliant QRT-PCR Master Mix Kit,1-StepBrilliant QRT-PCR Plus Core Reagent Kit,1-Step,1-step RT-PCR,Brilliant QRT-PCR Core Reagent Kit,2-StepBrilliant QRT-PCR Plus Core Reagent Kit,2-Step,Brilliant Probe-based QPCR Reagents,2-fold discrimin
17、ation using the Brilliant SYBR QPCR master mix on the Mx3000P instrumentCt variation 0.5Cts,10,000 copies,5,000 copies,Brilliant QPCR Kits,Target=Beta actin/Template=Human genomic DNA36 wells of 10,000 copies with a Ct variation of 0.5 Cts and 36 wells of 5,000 copies with Ct variation of 0.5Cts,引物探
18、针设计软件,设计SYBR Green 引物,TaqMan 探针,FRET 探针和 Molecular beacons（分子信标）,快速,简单,功能强大,独特优点能高效设计双标记探针(Taqman,FRET探针,分子信标等)优化的引物设计能适应不同的荧光定量PCR方法能进行等位基因分析与多重定量PCR探针设计有二级结构分析功能,能图形化显示各种位置与结构内置BLAST连接,BeaconDesigner 4.0 工作界面,Fast Track QPCR 培训项目,优势：快速有效的 QPCR 培训；更高层次的QPCR应用培训；能满足客户的不同要求；从入门到高级的完全覆盖；用户能直接咨询Stratag
19、ene的QPCR应用 专家,Fast Track培训内容,Web-seminar（网络讲座）Introduction to QPCR Guide（QPCR入门向导）Regional QPCRUser Group Meetings（区域内用户会议）FAS（Field Application Scientist）会诊,Stratagene Mx3000P优势总结,全新的开放式PCR平台:可以选择任何荧光染料、试剂和耗材，毫无限制。真正的4通道定量PCR技术，具有高超的分辨力与灵敏度。一体化设计，将扩增系统与检测系统完美结合，带来超强的稳定性。第一个快速定量PCR系统，带来极高的实验效率。人性化的软件设计，操作方便，断电时数据瞬间保存，使您的实验得到最大保障。Beacon Designer 4.0 引物探针设计软件操作快速简单功能强大.完善优良的培训与技术服务项目。高性价比：让定量PCR仪不再是价高不敢问津的高端仪器。,Thank you！,选择吉泰，选择成功！,
