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1、第一章 酶,DNA重组技术的基本工具,分子手术刀限制性内切酶,分子缝合针DNA连接酶,分子运输车运载体,工具酶,限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶,重组DNA技术中常用的工具酶,一、限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease)这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。,+,Bam H,（一）限制性核酸内切酶的发现（二）限制性核酸内切酶的分类（三）II型限制性核酸内切酶的基本特性（四）限制性核酸内切酶的命名（五）限制性核酸内切酶的消化反
2、应,（一）限制性核酸内切酶的发现 限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源的一类酶，其功能是避免外源的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。寄主控制的限制（restriction）与修饰(modification)现象：人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。由寄主控制,R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶,E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶 当(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB
3、的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。,R/M体系的作用：类似于免疫系统 保护自身的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。,（二）限制性核酸内切酶的分类根据酶的功能、大小和反应条件，及切割的特点，可以将限制性内切酶分为三类：型酶、型酶、型酶（基因工程技术中常用的是类）,I类 能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近切割双链，但切割序列没有专一性。II类 识别位点（回文序列）严格专一，并在识
4、别位点内将双链切断。III类 识别位点严格专一（不是回文序列），但切点不专一，往往不在识别位点内部。因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶。,型酶：1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。分子量较大，反应需Mg+、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。,型酶 1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出来的限制酶。分子量较小（105Da），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg+的
5、存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。许多型酶切割后，可在上形成粘性末端，有利于片段的重组。,型酶 这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3端2426bp处切开，所以它的切割位点也是没有特异性的。,限制性核酸内切酶的类型,主要特性 I 型 II 型 III 型,蛋白结构,异源三聚体,同源二聚体,异源二聚体,切割位点,距识别序列1kb处,识别序列内或附近,距识别序列下游,随机性切割,特异性切割,24-26bp处,a.限制酶识别靶序列同DNA的来源无关；,（三）II型限制性核酸内切酶的基本特性,a.识
6、别位点的特异性识别靶序列是唯一的，通常是由48个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。b.识别序列的对称性 靶序列通常具有双重旋转对称的结构，以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称，重复排列切割序列呈典型的旋转对称型回文结构(palindrome)如：GAA TTC CCC GGG CTT AAG GGG CCC,c.大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧,d.核酸内切酶作用后的断裂方式粘性末端：两条链上的断裂位置是交错地、但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片断。平末端 两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断。不易重新
7、环化。,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,EcoRI等产生的5粘性末端,EcoRI 37,退火 4-7,5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5,OH,P,OH,P,同裂酶（isoschizomers)指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。Example:限制酶Hpa和Msp是一对同裂酶(CCGG)，当靶序列中一个5-甲基胞嘧啶时Hpa不能进行切割，而Msp可以。,同尾酶（isocaudamer）指来源不同、识别靶序列不同但产生相同
8、的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,注 意：由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。EcoR I:来自于Escheria coli RY13的第一个限制酶。,（四）限制性核酸内切酶的命名,Hin d,属 系 株 序,Haemophilus influenza
9、e d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶,（五）限制性核酸内切酶的消化反应,一个限制酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37）下，1h内中完全降解1 g DNA所需要的酶量。,（一）酶 切 反 应 的 基 本 步 骤,电泳,紫外分析,37 1h,加反应液,CK,M,Buffer(10X)2.0 LddH2O 约16.5 LDNA 0.21.0 gEnzyme 12UVolume 20.0 L,1.0kb,1.0kb,0.4kb,0.5kb,0.6kb,CK,M,T,T,0-50 mM 低盐酶100 mM 中盐酶150 mM 高盐酶II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：（2-1
10、）对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：（2-2）对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：,使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切,（二）影响核酸内切酶活性的因素：1.DNA的纯度：DNase的污染(Mg+)a.增加核酸内切限制酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶 b.扩大酶催化反应的体系（稀释），c.延长酶催化反应时间。加入亚精胺提高酶的消化作用，需适当的温度。,2.DNA的甲基化程度大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，
11、但BamH I、Bgl II、Sau3A I不受影响,3.酶切消化反应的温度：大多数酶的标准反应温度 37度。4.DNA的分子结构：某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA高29倍。,（三）核酸内切限制酶标准的缓冲液1.氯化镁、氯化钠或氯化钾：不正确的NaCl或Mg+浓度，会降低限制酶的活性，还可能导致识别序列的改变。2.Tris-HCl：维持最适的pH值（pH 7.4）。3.-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）：维持酶的稳定性。4.牛血清蛋白（BSA）：维持酶的稳定性。,（四）核酸内切限制酶对DNA的消化作用1.核酸内切限制酶以同型二聚体形式与靶序列发生作用
12、。2.核酸内切限制酶对DNA的局部消化完全的酶切消化：识别序列n个碱基的核酸内切限制酶，对DNA的切割能达到每隔4n切割一次的水平。局部酶切消化：不让核酸内切限制酶对大量的DNA消化完全，就可以获得平均分子量大小有所增加的限制片断产物，进行不完全的限制酶消化反应。a.缩短酶切的消化反应的保温时间 b.降低反应的温度（37-4）结束酶的活性。,3.核酸内切限制酶对真核生物基因组的消化作用小分子量的片断-少（电泳-容易分离目的片断）大分子量的片断-多（基因文库）,星号活性？,在“非最适的”反应条件下,有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分
13、子，这种现象叫星号活性。用*表示。,连接酶（DNA ligase）与分子的体外连接,末端核苷酸转移酶（terminal transferase）该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase），它是从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质，在二甲胂酸缓冲液中，能催化5脱氧核苷三磷酸进行53方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3-OH末端。它不需要模板，可以用含有的3-OH片段为引物，在3-OH端加入核苷酸达几百个。它作用的底物可以是具有3-OH末端的单链DNA,也可以是具有3-OH突出末端的双链DNA,用途
14、：1.催化-32P-3-脱氧核苷酸标记DNA片断的3 末端。可用于测序的终止，一位不含游离的3-OH末端。2.催化非放射性的标记物掺入到DNA片断的3-末端：生物素等，掺入后可产生荧光染料或抗生物素蛋白结合物的接受位点。3.用于在平头上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。,碱性磷酸酶：来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase BAP）或小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase CIP），该酶用于脱去DNA（RNA）5末端的磷酸根，使5-P成为5-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5端同位素标记或为了避免DNA
15、片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。,S1核酸酶：来自于稻谷曲霉，该酶只水解单链DNA，用于将粘性末端水解成平末端及cDNA发夹式结构的处理。反转录酶（reverse transcriptase）这类酶来自于反转录病毒，它可以RNA为模板，催化合成。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反转录酶两种。,体外连接的三种方式：1.用连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断 2.用连接酶将平末端的DNA片断连接；或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片断加上poly(A)-poly(T)尾巴之后，再用连接酶连接。3.先在DNA片断末端加上化学合成的衔接物或接头，形成粘性末端后，再用
16、连接酶连接,连接酶：能够将DNA链上彼此相邻的3-羟基（OH）和5-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。,酶AMP（腺苷磷酸）磷酸酰胺键,DNA的腺苷酸复合物3-OH对P原子作亲核攻击 形成磷酸二酯键,连接酶的作用机理,此反应是由焦磷酸(ppi)的水解作用激发的需要花费两个高能磷酸键,（赖氨酸残基）,限制片断的末端连接作用 分子间的连接：不同的DNA片断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形
17、分子。,连接酶的来源 1.DNA连接酶：大肠杆菌染色体编码的 2.T4 DNA连接酶：大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的 DNA连接酶 NAD+T4 DNA连接酶 ATP,连接酶（DNA ligase）该酶常从噬菌体的受感细胞中提取，是由噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是连接酶。它可催化中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。,影响连接酶作用的因素 1.反应温度：连接缺口的温度：37度 连接粘性末端的最佳温度：415度 2.连接酶的用量
18、：平末端DNA分子的连接反应中，最适12个单位。粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。ATP的用量10mol1mmol/L之间 3.提高外源片断与载体的浓度的比值，（1020倍）,粘性末端DAN片断的连接 由于具粘性末端的载体易发生自连。对载体的5末端进行处理，用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶移去磷酸基团，使载体不能自连。而外源片断的5-P能与载体的3-OH进行共价键的连接。这样形成的杂种分子中，每一个连接位点中载体DNA只有一条链与外源片断相连，失去5-P的链不能进行连接，形成3-OH 和5-OH 的缺口。,平末端DNA片断的连接 1.T4DNA连接酶 2.用末端核苷酸转移酶给平末端
19、加上同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶连接。常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法,同聚物加尾法,用5 末端特异的核酸外切酶处理DNA片断,在A和B分别中加入dATP和dTTP,同聚物尾巴1040个碱基,同聚物加尾法或T4连接酶的平末端连接法，无法用原来的限制酶作特异性的切割，获得插入片断进行进一步的研究。,衔接物连接法 平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约1020个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。如：CCGGATCCGG GGCCTAGGCC 将衔接物分子与平末端DNA
20、分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。,Hpa II Hpa II,BamH I 或Sau3A,衔接物（linker）是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。双衔接物：可以实现定向克隆，防止发生自连，同时对克隆片断的再删除也比较方便。,衔接物连接法,双衔接物连接法的基本程序,cDNA链的合成,通过DNA聚合酶合成第二链,加入Sal I衔接物,S I核酸酶作用后的末端单链突出序列，由Klenow补齐，加入第二衔接物Ecol I,在用DNA衔接物连接法时，如果待克隆DNA
21、的片断或基因内部，含有与所加衔接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因切断。,DNA接头（adapter）连接法：1978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞 博士发明的。它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子。对DNA接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性末端5-P，暴露出5-OH，不能产生稳定的二聚体分子。,DNA接头连接法,热稳定的连接 从嗜热高温方线菌的菌株中分离出来的。能在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接用的一种核酸酶。寡核苷酸连接测定（ol
22、igonucletide ligation assay,OLA）用两个寡核苷酸探针，同已知序列的靶DNA杂交，探针在靶 DNA分子的位置是相邻的。连接酶链式反应（lingase chain reaction,LCR）；也叫连接扩增反应（lingase amplication reaction）用寡核苷酸探针通过DNA连接酶的作用扩增已知序列的靶DNA的方法。需要4种引物，,寡核苷酸连接测定 AGTGACCT TCACTGGA A G T G A C C T A G T T A C C T T C A C T G G A T C A C T G G A A G T G A C C T A C C
23、 T A G T G A C C T A C C T,待扩增的DNA片断,P,P,B,B,D,D,地高辛配基,生物素,磷酸,B,B,B,B,D,D,P,P,阳性信号,无信号,酶抗生素蛋白,由于碱基错配不能形成磷酸二酯键,检测单碱基的取代、插入、及缺失而引起的多态性,LCR：ligase chain reaction，连接酶链式反应。,样品DNA、探针(4)94度变性,DNA聚合酶,常用的DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片断酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、反转录酶等。,共同点：把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸
24、的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况。,大肠杆菌DNA聚合酶 DNA聚合酶（Pol）、DNA聚合酶（Pol）、DNA聚合酶（Pol）、Pol和Pol 的主要功能参与DNA的合成；Pol 的功能同DNA的复制有关；Pol同DNA分子克隆的关系最为密切。,大肠杆菌DNA聚合酶：1957年，美国的生物学家A.Kornberg首次证实，在大肠杆菌提取物中存在一种DNA聚合酶，即现在所说的DNA聚合酶。由pol基因编码的一种单链多肽蛋白质，分子量为1091000dal。DNA聚合酶，可以被蛋白酶切割成两个片断，一个具有全部的3 5的外切酶活性和5 3 的聚合酶活性，另一个具有全部 5 3的外切酶活
25、性。,DNA聚合酶的酶活性：1.5 3的聚合酶活性；2.5 3的外切酶活性；3.3 5的外切酶活性（较低）。,DNA聚合酶发挥作用的条件：1、底物：四种脱氧核苷5-三磷酸（dNTP）；2、Mg离子；3、带有3-OH游离基团的引物链；4、DNA模板：单链，双链（糖-磷酸主键上有一个 或多个断裂）。,DNA聚合酶5 3的核酸外切酶活性 1、5 3的外切酶活性，所切割的DNA链必须是位于双螺旋的区段上；2、切割部位可以是末端磷酸二酯键，也可以是在距5末端数个核苷酸远的一个键上发生；3、DNA的合成可以增强5 3的核酸外切酶活性；4、5 3核酸外切酶的活性位点同聚合作用的活性位点以及3 5的水解作用位
26、点是分开的。,DNA聚合酶的3 5 核酸外切酶活性 能催化DNA链发生水解作用，从DNA链3-OH末端开始向5的方向水解DNA，并释放出单核苷酸分子。对酶活的影响：反应物中缺乏dNTPs时，大肠杆菌DNA聚合酶的3 5核酸外切酶活性，将会发挥作用。但对于底物是双链的DNA，在具有dNTPs时，这种降解活性将会被5 3 的聚合酶活性所抑制。,DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：通过DNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。DNA缺口转移（nick translation）在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶的5 3核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的
27、5一侧移去一个5核苷酸之后，聚合酶作用就会在缺口的3一侧补上一个新的核苷酸，但pol不能在3-OH和5-P之间形成一个键，随着5一侧的核苷酸不断移去，3一侧的核苷酸又按序列增补，缺口便沿着DNA分子合成的方向移动。,DNA杂交探针的制备 典型的反应体系是。在25l总体积中含有1 g纯化的特定DNA片断，并加入适量的Dnase、Pol、-32p-dNTPs和未标记的dNTPs。Dnase：造成DNA分子的断裂或缺口；Pol：进行缺口转移，使反应混合物中的32p标记的核苷酸取代原有的未标记的核苷酸，最终从头到尾都被标记。,dNTP 对Pol酶活性的影响 在低浓度dNTPs的条件下，Pol具有良好的
28、活性，提高dNTPs浓度时，Pol则能够更有效的合成DNA。低浓度的 32p-dNTPs（2 mol/L）和高浓度的dNTPs（20 mol/L）一般希望有30%左右的32p-dNTPs参入DNA链（Dnase数量）。,Klenow片断与DNA末端标记 1、Klenow片断：是由大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶的处理之后，产生出来的分子量为761000dal的大片断分子。仍具有5 3的聚合酶活性和3 5 的外切酶活性，失去了全酶的5 3 外切酶活性。,Klenow片断的主要用途：1、修补经限制酶消化的DNA所形成的3隐蔽末端；2、标记DNA片断的末端；3、cDNA克隆的第二链cDNA的合成
29、；4、DNA序列的测定。,DNA片断末端标记：具有 3隐蔽末端的带标记得的DNA片断 5GATCT3 3 A5在反应物中加入Klenow聚合酶-32p-dGTP,一道温育后生成：5GATCT3 3 32p GA5 或是同时加入-32p-dATP dGTP5GATCT3332p AGA5,DNA片断末端标记可以作为用凝胶电泳法测定分子大小的标记样品。因为被标记的DNA片断是同它们的摩尔浓度成比例，而与他们的分子大小无关。所以在限制酶消化过程产生的大小DNA片断都得到了同等程度的标记。不能够有效的标记带有5突出末端的DNA分子。,T4DNA聚合酶和 取代合成法标记DNA片断 1、从T4噬菌体感染的
30、大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的DNA聚合酶。具有5 3的聚合酶活性和3 5 的外切酶活性。2、在没有脱氧核苷三磷酸存在的情况下，3外切酶活性便是T4 DNA聚合酶的独特功能。作用于双链DNA片断，并按3 5的方向从3-OH末端开始降解DNA。如果反应物中存在一种dNTP时，它的水解作用进行到暴露出同反应物中唯一的dNTP互补的核苷酸时就会停止。3、在反应过程中，通过T4 DNA聚合作用，反应物中的-32p-dNTP逐渐地取代了被外切活性删除掉的DNA片断上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。,合成取代法优于缺口转移法：1、不会出现发夹结构而缺口转移制备的探针会出现这种结构；2、应用适宜的核酸内
31、切限制酶切割，便可很容易的变成特定序列的探针。,具EcoR1位点的DNA分子,对DNA分子3端有控制的降解,合成作用产生选择性标记,T4DNA聚合酶的取代合成法标记DNA断末端及制备链的特异探针,反转录酶：具有反转录酶活性和RNaseH活性。主要作用是以mRNA为模板合成cDNA；用来对5突出末端的DNA片断作末端标记。,合成cDNA的主要步骤：1、应用poly(A)mRNA为模板，以1218个碱基长的oligo(dT)片断作为引物，加入反转录酶，合成出cDNA第一链;2、用碱水解法除去mRNA模板，单链cDNA能自我折叠形成一种发夹结构，作第二链的引物，用反转录酶或Klenow聚合酶催化第二
32、链cDNA的合成；3、用S核酸内切酶消化除去单链区的发夹结构。4、通过同聚物或合成的衔接物，使DNA分子克隆到适当的载体分子上。,T7DNA聚合酶：1978年，S.Tabor从感染了T7噬菌体的大肠杆菌寄主细胞中纯化出来的一种核酸酶。具有5 3的聚合酶活性和很高的单链及双链的3 5核酸外切酶活性。,T7DNA聚合酶的用途：1、用于对大分子量模板的延伸合成；（不受DNA二级结构的影响，聚合能力较强可 延伸合成数千个核苷酸）2、通过延伸或取代合成法标记DNA3末端 3、将双链DNA的5或3突出末端转变成平末 端的结构。,修饰的T7DNA聚合酶 对天然的T7DNA聚合酶进行修饰，使之完全失去3 5的外切酶活性。聚合作用的速率增加了3倍。,用途：1、作为一种DNA序列分析的工具酶：加工性能高；无3 5的外切酶活性；具有催化脱氧核糖类似物聚合的能力。2、制备探针；可催化较低水平的dNTP（0.1 mol/L）参入。3、有效的填补和标记具有5突出末端 的DNA片断的3-末端。聚合作用高；失去了3 5的外切酶活性,
