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1、第三章 工具酶 基因工程使用的工具酶具有一个重要特征：每一种酶都具有自身特定的功能。有的像手术刀，可以进行DNA分子的特定切割；有的像粘合剂，可以促进DNA分子之间的粘合和连接；有的像砌砖机，可以合成完整的双链DNA分子。,核糖核酸酶(Rnase)专门水解断裂RNA分子,脱氧核糖核酸酶(DNase)特异水解断裂DNA分子。按水解断裂核酸分子的不同方式核酸酶分为两种类型：核酸外切酶(exonuclease):从核酸分子的末端开始，一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链。核酸内切酶(endonuclease):从核酸分子 内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段。,核酸酶:通过切割相邻的两个核苷酸残
2、基之间的磷酸二酯键，使核酸分子多核苷酸发生水解断裂的酶。,常用的工具酶：,工具酶,一把特殊的剪刀_限制性内切酶,1.限制性内切酶的发现,阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖,Lurva和Human（1952）以及Bertani和Weigle（1953）发现了噬菌体的限制作用，即在一种宿主细胞生长良好的噬菌体，但在另一种宿主细胞中生长很差。修饰作用：第二个寄主菌株赋予噬菌体非遗传的变化，使之再感染时能够有效生长，而没有再次受到限制的现象。限制作用和修饰作用都是由寄主控制，统称为寄主控制的限制与修饰现象。,第一节限制性内切酶Rest
3、riction Enzyme(RE),限制作用的本质是限制酶的切割反应，修饰作用的本质则是甲基化酶的甲基化作用。Hsd R:编码限制酶；hsd M:编码甲基化酶；hsd S：表达产物协助上述两种酶识别特殊的作用位点。当有DNA入侵细菌时，修饰酶修饰宿主自身的DNA，使之打上标记，避免自身的DNA被限制性内切酶分解；限制酶降解外来的DNA，自身DNA由于修饰酶的甲基化而受到保护。限制性酶与DNA甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统,限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并在识别位点或其附近切割DNA双链的核酸内切酶。主要是从原核生物中分离纯化出来的。据统计数字，仅型核酸内
4、切限制酶一项迄今就已从各种不同的微生物当中，分离出了2300种以上、可识别230种不同的DNA序列。目前已经发现3500种以上，而且商业化的有250种之多,第一节限制性内切酶Restriction Enzyme(RE),2.限制酶的命名,现在通用的命名原则是：第一个字是细菌属名的第一个字母，第二、三个字是细菌种名的前二个字母，这些字母都用斜体字母；接下去是细菌菌株的第一个字母，用正体字母书写。如果同一菌株中有几种不同的内切酶时，则分别用罗马数字、来代表。现在列表举例说明如下,EcoRI,表示大肠杆菌属名第一个字母,E：,表示种名头两个字母,表示菌株名第一个字母,R：,表示该菌中第一个被分离出来
5、的酶。,I：,co：,几种限制性内切酶命名原则举例,I型：能识别专一的核苷酸顺序，在距识别点数千碱基处随机切割DNA分子中的双链。III型：有专一的识别顺序。它在识别顺序下游约25bp处几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。II型：识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内或附近的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA片段，并能构建来自不同基因组的DNA片段，形成杂合DNA分子。,3.限制酶的种类根据限制酶识别和切割DNA的特点，可将限制酶分为I、II、III三种类型.,绝大多数的型核酸内切限制酶，都能够识别由
6、4一6个核苷酸对组成的特定的核苷酸序列，我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。而限制酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此识别序列又称内切酶的靶子序列。识别序列通常具有二重旋转对称轴，序列呈回文结构（palindromic structure）。即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”核苷酸顺序都完全相同。,4.型限制性核酸内切酶的基本特性：4.1型限制性内切酶的识别序列,E coR I的识别顺序为：5GAA|TTC33CTT|AAG5垂直虚线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。,recognition s
7、equence enzymes 5 GTT AAC 3 Hpa blunt end 3 CAATTG 5 5 GAATTC 3 EcoR 5protruding end 3 CTTAAG 5 5 AAGCTT 3 Hind 5protruding end 3 TTCGAA 5 5 GGATCC 3 BamH 5protruding end 3 CCTAGG 5 5 CTGCAG 3 Pst 3protruding end 3 GACGTC 5,识别序列在DNA分子中出现的频率:,如果四种碱基按完全随机分布的原则，则某种限制性内切酶识别序列在DNA分子中出现的频率为（1/4）n n为识别序列的核
8、苷酸数目。,但实际上未必所有的限制性核酸内切酶识别序列的出现概率都符合这样的规律。往往是富AT的识别序列在富AT的DNA分子中出现的概率高，在富GC的DNA分子中出现的概率低；而富GC的识别序列在富AT的DNA分子中出现的概率低，在富GC的DNA分子中出现的概率高。,由于那些长的识别序列和富GC或富AT的识别序列在DNA分子中出现的概率很低，所以把这些识别序列相应的限制性核酸内切酶称为稀切酶(rare cutting enzymes)。,有的限制性核酸内切酶可识别两种以上的核苷酸序列。如Acc I既可识别GTATAC，又可识别GTCGAC；Dde I可识别的核苷酸序列有CTAAG、CTTAG、
9、CTGAG和CTCAG。这样的限制性核酸内切酶为获得多种酶切片段提供了方便。,4.2型限制性内切酶的酶切特点,绝大多数型限制性内切酶在其识别顺序切割双链DNA，水解磷酸二酯键，产生3OH和5 P片段。这种酶的切割可以有两种方式。一是交错切割，结果形成两条单链末端，这种单链末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如果切点在中轴的左上侧和右下侧,则产生5突出粘性末端（cohesive end）:5GAATT C3 5GOHpTTAAC33C ATAAG5 EcoR 3CTTAAp OHG5,如果切点在中轴的左上侧和右下侧,则产生3突出的粘性末端：5CTGCAG3 5CTGCAOHp
10、G33GACGTC5Pst 3GpOHACGTC5,另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端，即碱基 配对完好的末端。例如Hae的识别位置是：5TCGCGA3 5TCGOH pCGA3 3AGCGCT5 3AGCp OHGCT5,粘性末端与平头末端,核酸内切限制酶HindIII对双链DNA分子的切割作用,有些来源不同的限制酶却识别和切割相同的序列，这类限制酶称为同裂酶。同裂酶产生同样切割，形成同样的末端，酶切后所得到的DNA片段经连接后所形成重组序列，仍可能被原来的限制酶所切割。同裂酶的反应条件可能存在差异。,5.同裂酶（Isoschizomers）:,“完全同裂酶”能识别和切割完全相同的序
11、列，如Hind III与Hsu I，（A/AGCTT）“不完全同裂酶”虽能识别相同序列，但切割方式不同，如Xma I和Sma I。（CCCG/GGG和CCC/GGG）,同裂酶（Isoschizomers）:,6.同尾酶(Isocaudomers),有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但却能产生出相同的粘性末端，这类限制酶称为同尾酶。但两种同尾酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列，不能被原来的限制酶所识别和切割。,MunI：,5-C A A T T G-33-G T T A A C-5,EcoR I：,5-G A A T T C-33-C T T A A G-5,5-C A
12、A T T G-33-G T T A A C-5,5-G A A T T C-33-C T T A A G-5,重新连接后的序列：,5-C A A T T C-33-G T T A A G-5,（1）识别顺序不同，切割方式也不同;(如EcoR和Pst I，前者产生的是5粘端，后者产生的是3粘端。)（2）识别顺序不同，切割产生的粘末端相同；(同尾酶)（3）识别顺序相同，切割方式不同；(如Sma I与ma I)（4）相同的识别顺序，切割方式亦相同；,7.限制酶的识别位点与切割方式之间的关系：,核酸内切限制酶的单位是这样定义的，在20ul终反应体系中，1h完全酶解1 g 底物DNA所需要的酶量，为l
13、个单位的内切酶（1U）。,DNA 1g 限制性内切酶反应10缓冲液 2l:Mg2+Tris-Hcl-巯基乙醇等 重蒸水 16l 酶液 1l,反应体系,8影响核酸内切限制酶活性的因素：,（1）DNA样品的纯度：（2）DNA的甲基化程度：（3）酶切消化反应的温度：（4）DNA的分子结构：（5）核酸内切限制酶的缓冲液：(6)酶的纯度,内切酶的星号活性：在某些反应条件下，识别顺序的特异性可能发生变化，可能切割一些与特异识别序列相类似的序列。最常见的例子是EcoR I，一般条件下它识别GAATTC六个核苷酸顺序，而EcoR I(表现有星号活性)，仅能识别AATT四个核苷酸的顺序。,促使内切酶产生星号活性
14、的因素有多种，主要由如下一些因素引起。（1）甘油浓度过高。这是引起星号反应的常见原因。（2）离子强度不合适。某些内切酶需要在高盐缓冲液中进行反应，盐浓度降低也可能引起星号反应。（3）阳离子变化。若将Mg2+改为Mn2+可能促使EcoR和Hind 产生星号活性。（4）溶液中pH变化。如用EcoR I酶切时，反应溶液的pH值由7.5升高到8.5时也会出现星号反应。（5）有机溶剂残留的影响。,9.核酸内切限制酶在分子克隆中的应用 限制酶是分子克隆中最常用的工具酶，可以这么说：只要进行分子克隆操作，就必定要用限制酶，归纳起来，主要用在这几方面：DNA重组，组建新质粒，DNA分子杂交，制备DNA放射性探
15、针，绘制DNA物理图谱，DNA序列分析，DNA甲基化碱基的识别与切割，基因定位及DNA同源性研究。,第二节甲基化酶,甲基化酶同限制性内切酶成对存在。它们具有完全相同的识别顺序。甲基化酶使识别顺序中的某个碱基发生甲基化，保护DNA不被限制性内切酶切开。甲基化酶在分子克隆中相当有用，可保护基因组DNA中的特定部位不被切割。,DNA连接酶(Iigase)：能借助ATP或NAD水解提供的能量催化2条双链DNA片段紧靠在一起的3羟基末端与5磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接的酶。,第三节DNA连接酶,1.DNA连接酶的作用机理,DNA连接酶与细胞内的能源分子形成复合物，“用力拉住”5-P末端并
16、将其“送到”3-OH末端上，促使两者形成磷酸二酯键，实现两个DNA分子的连接。细胞内的能源分子主要是指烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和腺苷三磷酸（ATP）。,E.coli DNA连接酶：简称DNA连接酶，是由大肠杆菌染色体编码的。只能催化双链DNA片段黏性末端之间的连接，不能催化双链DNA片段平末端之间的连接。用NAD+作能源辅助因子。T4DNA连接酶：是由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的。既可用于双链DNA片段黏性末端之间的连接，也能催化双链DNA片段平末端之间的连接，但平末端之间连接的效率比较低。用ATP作作能源辅助因子。连接反应的最佳温度为4-15,2.连接酶的种类,（1）粘性末端连接,
17、由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的粘性末端，或由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段，具有相同类型的粘性末端，都可以在DNA连接酶催化作用下形成共价结合的重组DNA分子。,3.DNA片段的连接特点和连接方式,具有粘性末端的DNA片段结合方式,（2）平末端连接用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连按起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly(dA)-poly(dT)同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。,（3）同聚物加尾连接 运用末端脱氧核苷酸转移酶，将核苷酸一个一个加到DNA分子的单链延伸末端的3-OH上形成长度可达100个核
18、苷酸的尾。如poly(dA)尾巴。要在平末端的DNA分子上产生3-OH单链末端，需用5-特异核酸外切酶处理，移去几个碱基即可。对任意两条DNA分子，只要分别获poly(dA)-poly(dT)或poly(dC)-poly(dG)同聚物尾巴，就会彼此连接起来。留下的单链缺口则由DNA连接酶封闭。单链裂口可以通过大肠杆菌DNA聚合酶1的作用填补。这种连接DNA分子的方法称为同聚物尾巴连接法。,应用互补的同聚物加尾法连接DNA片段,（4）人工接头连接人工接头连接法分为两种：一种是DNA连接子（linker)法,一种 DNA接头法。DNA连接子也称衔接物：是指一段人工合成的具有平末端的双链寡核苷酸片段
19、，长度为8-12个，具有一种以上限制酶识别位点。DNA接头法：也是指一段人工合成寡核苷酸片段，它的序列中包含了限制酶粘性末端，不需要用限制酶酶切。,用衔接物分子连接平末端的DNA片段,第四节 DNA聚合酶,分子生物学研究工作中经常使用的DNA聚合酶，有大肠杆菌DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片段酶(Klenow酶)、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、修饰的T7DNA聚合酶以及反转录酶等。这些DNA聚合酶的共同特点在于，它们都能够把脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。,1大肠杆菌DNA聚合酶(E.coli D
20、NA Pol I)：大肠杆菌DNA聚合酶由大小两个亚基组成，具有3种酶活性，即大亚基的53DNA聚合酶活性，35外切酶活性及小亚基的53DNA外切酶活性。,(1)53DNA聚合酶活性：需要以单链DNA作模板，并需要引物，该引物的3为一OH。,DNA聚合酶I催化合成DNA合成链按53方向延长,(2)35外切酶活性：即从游离的3一OH末端降解单链或双链DNA成为单核苷酸，其意义在于识别和消除不配对的核苷酸，保证DNA复制的忠实性。,(3)53外切酶活性：从5一OH末端降解双链DNA成单核苷酸或寡核昔酸。也降解DNARNA杂交体的RNA成分(本核酸酶具有RNA酶H活性)。,DNA聚合酶I的主要用途：
21、,1.缺口平移制作标记 DNA 探针。,应用DNA缺口转移法制备DNA杂交探针的典型的反应体系是：在一定反应体积中加入一定量纯化的DNA片段，并加入适量DNase，DNA聚合酶，-32P-dNTPs和未标记的dNTPs。,其中，DNase的作用是在DNA分子上造成断裂或缺口，使之带有3-OH末端；随后DNA聚合酶的53的核酸外切酶的活性从缺口的5-P一侧移去一至数个核苷酸；同时，DNA聚合酶的53的聚合酶的活性将-32P-dNTPs和未标记的dNTPs随机掺入，取代已经被移走的核苷酸；DNA聚合酶的53的聚合酶的活性和53的核酸外切酶的活性不断地重复以上的作用，使DNase造成的缺口沿着53的
22、方向移动。5-P侧的核苷酸不断被移去；3-OH侧的核苷酸又按序填上，形成带上了-32P-dNTPs标记的新合成的DNA链，取代了原有的未标记的DNA链。这种使DNA带上放射性同位素标记的过程就被形象地称为缺口平移法。,2.合成cDNA的第二链3.填补双链DNA3凹端4.DNA序列分析,2.大肠杆菌DNA聚合酶大片段(Klenow)酶：该酶是用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解大肠杆菌DNA聚合酶I而得到的该酶大片段，亦称Klenow酶，从全酶中去除了53外切酶活性，保留了53DNA聚合酶活性及35外切酶活性。,在基因工程中的主要用途是：修补经限制性核酸内切酶作用而产生的3隐蔽末端；标记DNA片段的末
23、端；合成cDNA克隆中的cDNA的第二条链；DNA序列测定；DNA定点突变。,Klenow片段修补经限制性核酸内切酶作用而产生的DNA的3隐蔽末端的过程参见图：,3T4噬菌体DNA聚合酶：,它具有二种酶活性，53的聚合酶活性和35的核酸外切酶活性，但其35外切酶活性对单链作用比对双链DNA更强。它可以跟Klenow片段一样用来标记DNA的末端。在没有dNTP存在的情况下，35的核酸外切酶活性便是T4 DNA聚合酶的独特功能，35的核酸外切酶活性远高于Klenow片段。如果反应混合物中只有一种dNTP，那么这种降解作用进行到暴露出同反应物中唯一的dNTP互补的核苷酸是就会停止。这种降解限制使得D
24、NA的核苷酸删除受到控制，从而产生具有一定长度的3凹端的DNA片段。于是在反应物中加入已标记的dNTP，这种局部消化的DNA片段便作为引物及模板，T4噬菌体DNA聚合酶的聚合作用超过外切作用，因此出现了DNA净合成反应，重新合成了完整的具有标记末端的DNA分子。该酶用途基本与Klenow一致。,用T4DNA聚合酶的取代合成法标记DNA片段末端制备探针,由于在反应中带同位素标记的核苷酸逐渐地取代了被外切活性删除的DNA片段上原有的核苷酸，因此形象地将这种作用叫做取代合成法。,其作用与Klenow酶相似，具有53聚合酶活性及35外切酶活性。该酶是所有DNA聚合酶中持续合成能力最强的一个，所合成的D
25、NA的长度亦比其他聚合酶长得多。其35外切酶活性比Klenow酶强1000倍。该酶的用途与T4DNA聚合酶相似。另外还可用于拷贝长段模板的引物延伸反应。,4T7噬菌体DNA聚合酶：,测序酶是经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶，该酶具有53的聚合酶活性，其持续合成能力很强，而35外切酶活性则是丧失的，故该酶是Sanger双脱氧测序法对长片段DNA进行序列分析的理想用酶。,5测序酶：,该酶是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，具有53聚合酶活性及3 5外切酶活性，聚合酶的最适反应温度为72。该酶的主要用途是进行PCR反应。,6TaqDNA聚合酶：,6逆转录酶(依赖于RNA的DNA聚合酶)：,逆转录酶
26、（Reverse transcripatase）是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。商品化的逆转录酶有两种:一种来自禽成髓细胞瘤病毒(AM)，另一种来自大肠杆菌中表达的Molonoy鼠白血病病毒(Mo-ML)逆转录酶。它们均具有依赖于RNA的53DNA聚合酶活性和依赖于DNA的53DNA聚合酶活性，其底物是RNA或DNA模板及带3一OH的RNA或DNA引物。以及RNA酶H活性(53及35外切核糖核酸酶活性)：能持续地、特异地降解RNA-DNA杂交体中的RNA。逆转录酶的主要作用是将mRNA反转录成cDNA，并可用反转录成的cDNA进行序列分析，再推导出RNA序列
27、。,第五节 修饰酶,1.碱性磷酸酶碱性磷酸酶的作用是将DNA末端中的5-端磷酸基除去，使其5-端变成了OH基。用于基因工程的碱性磷酸酶有两种：细菌碱性磷酸酶（BAP）和小牛肠碱性磷酸酶（CIP）。该酶有2个主要的用途：一是将载体末端的磷酸基除掉，避免在DNA重组时载体分子的自我连接；另一用途就是和T4多聚核苷酸激酶连用，用于DNA的末端标记。,2.T4多聚核苷酸激酶T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase)可将ATP中位上的磷酸基转移到具有5-端羟基的DNA或RNA分子上，常简称为T4激酶。,T4核苷酸激酶广泛用于DNA和RNA的5-末端标记，标记时以r-32PAT
28、P 作为底物。采用转移反应可获得高水平的末端标记，但反应前必须除去5-端未标记磷酸基。,3.末端转移酶(末端脱氧核苷酸转移酶)：末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxyribonucleotidyl Transferase,缩写为TdT)分离自小牛的胸腺，在二价离子存在条件下，催化dNTP加于DNA分子的3一OH端，DNA分子可以是单链，亦可是双链(主要是3一OH突出的双链)。在适当条件下，也可在DNA平末端或3凹端的3一OH端加上dNTP。,末端转移酶主要用于建立体外重组DNA分子时在DNA片段末端加上一个同聚物尾巴，两种不同的DNA分子加上不同的但可以互补(即A和T，C和G)的尾
29、巴后，经过退火或复性，两种尾巴便可以借助互补作用连接在一起。如果在反应系统中加入同位素标记的核苷酸，那么便可得到3-端标记的DNA分子。,第六节 核酸酶,1.核酸酶Sl：,核酸酶S1是一种只对单链DNA起作用的单链特异的核酸酶，在最适的反应条件下，降解单链DNA的速度非常快。核酸酶SI的主要功能是：催化RNA和单链DNA分子降解成5单核苷酸。同时还可以作用于双链核酸分子的单链区域，并在此处将一条完整的DNA切断成几段较小的DNA片段。,该酶用于去除DNA片段粘末端而产生平端。打开cDNA中发夹结构，使其成平端。分析DNA:RNA杂交体的结构，可证明基因内部内含子的存在。,脱氧核糖核酸酶(DNA
30、酶)：,为内切核酸酶，水解单链或双链DNA。用途：缺口平移法标记DNA时，先在DNA双链上随机产生切口，以及其它需产生单切口的用途。建立随机克隆，以便进行序列分析。,2.BAL31核酸酶：,该酶主要具有双链特异外切核酸酶活性和单链特异内切核酸酶活性。该酶的用途有：通过可控方式去除双链DNA的末端核苷酸，用于基因的克隆表达、缺失突变等。与限制性内切酶协同作用，建立物理图谱。确定DNA的二级结构，如Z-DNA与B-DNA的结合部位等。,Bal31 核酸酶的活性,应用Bal31核酸酶诱发DNA分子发生缺失突变,3核酸酶外切III(ExoIII)：催化双链DNA3羟基端逐一除去单核苷酸。此外还具有另二
31、种活性，即无嘌呤及嘧啶特异的内切核酸酶活性，RNA酶H活性及3磷酸酶活性(去除3末端磷酸)。作用：使双链DNA中产生单链区。,4.噬菌体核酸外切酶（exo）最初是从感染了噬菌体的大肠杆菌细胞中纯化出来的。这种酶催化双链DNA分子从5-P末端进行逐步的水解释放出5-单核苷酸。但不能降解5-OH末端。噬菌体核酸外切酶（exo）有二个方面的用途。第一，可将双链DNA转变成单链DNA，用于双脱氧法DNA序列分析。第二，从双链DNA中移去5突出末端，以便用于末端转移酶的加尾反应。,核酸外切酶（exo）能够从5-末端或3-末端呈单链状态的DNA分子上降解DNA，产生出寡核苷酸短片段，而且是唯一不需要Mg2+离子的活性酶，是一种耐受性很强的核酸酶。核酸外切酶（exo）可以用来测定基因组DNA中一些特殊的间隔序列和编码序列的位置。它只切割末端有单链突出的DNA分子。,
