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1、第十三章 植物灰分和各种营养元素的测定,Email:yangcHgnjA,概述,灰化的目的总灰分 样品经高温灼烧，有机物中的碳、氢、氧等物质与氧结合成二氧化碳和水蒸汽而碳化，残留物呈无色或灰白色的氧化物。粗灰分 燃烧时生成的炭粒不易完全烧尽，样品上可能粘附有少量的尘土或加工时混入的泥沙等，而且样品灼烧后无机盐组成有所改变，如：碳酸盐增加，氯化物和硝酸盐的挥发损失，有机磷、硫转变为磷酸盐和硫酸盐，质量均有改变。所以实际测定的总灰分只能是“粗灰分”。灰分元素磷、钾、钙、镁、钠和多种微量元素。,二、灰化的方法,一般灰化法；灰化后的残灰用水浸湿后再次灰化；灰化后的残灰用热水溶解过滤后再次灰化残渣；添加
2、醋酸镁或硝酸镁或碳酸钙等灰化；添加硫酸灰化。,各种试样灰化的条件,三、植物营养元素待测液的制备方法,灰化法灰化后用稀酸溶解酸溶法硫酸-双氧水；硫酸-高氯酸；硫酸-高氯酸-氢氟酸；硝酸-高氯酸-盐酸；盐酸或硝酸浸提。碱溶法碳酸钠、氢氧化钠或偏硼酸锂熔融,绿色环保消化技术微波消解,微波是一种高频电磁波，其频率为3 x 102一3 x 105MHz，波长从0.01mm到1m，包括分米波、厘米波、毫米波和亚毫米波，在电磁波谱系列中，其高频端与远红外线相邻，而低频端与普通无线电波的超短波衔接。微波热效应原理：物质的离子、极性分子及因电场作用而产生的极化分子在迅速交变的微波场中交替排列，高速振荡、摩擦和碰
3、撞而瞬间产生的。,微波在化学领域中的应用,微波能有助于物质的合成和分解试样；微波能测定水分；试样水分的测定，一般采用微波热效应烘干法，或试样介电常数测量法。此外还有用双模式微波传感器测量由于材料含水率不同而引起的两种模式谐振频率之差以测定水份。微波促进气固反应。美国Dow化学工业公司等报道了一种用炭吸附NOx后用微波处理使其还原成无害的氮气和二氧化碳的方法。张达欣等采用易吸收微波的活性炭为吸附剂和还原剂，不需任何催化剂，用3/4人同轴腔为反应器，微波辐射，将氮氧化物还原分解为无公害的N2和CO2气体。,微波消解的优点,1.速度快:消解可通过提高温度/压力协助反应，使反应物在特定温度下发生快速分
4、解，比普通消化快4-100倍完成。2.不改变反应方向：2450MHz微波只导致分子运动，不引起分子结构变化，大多数传统试剂不会因为其活性成分的蒸发而降低或失去强度，从而不会改变消解反应的方向。3.效率高：微波直接向样品释放能量，避免传统方式中能量的损失，提高了能量的使用效率。,4.准确：通过磁控管可控制分解条件，避免了人为操作产生的错误和误差。通过温压控制可以保证消解的质量，保证反应一致的平行性和重复性。5.避免过氯酸的使用：如HNO3在微波消化期间，基于消化瓶内压力的缘故，会产生较高的温度，可取代过氯酸的使用。6.防止元素的挥发元素、污染和毒害：如：As，Hg等可被保留在消化溶液中，降低的空
5、白值，操作人员避免接触酸雾和有害的气体，,微波消解仪,微波消解仪,微波消解罐,微波消解酸选择的一般准则,硝酸：广泛用于酸消解。能氧化侵蚀金属和有机物质。Au，Pt，Nb，Ta和Zr不能被硝酸溶解。Sn，Sb和形成不溶性的水合氧化物。能溶解大多数硫化物，UO2和U3O8。在起始反应后，可加入过氧化氢以使消解彻底。主要用于有机样品如脂肪、饮料、蛋白质、碳水化合物、植物材料、废水、一些颜料和聚合物。,盐酸：本身应用不广。用于溶解弱酸的盐，碳酸盐，磷酸盐和无机氧化物、(如Fe2O3)和铝金属重。硫酸：可完全破坏几乎所有的有机物，进行快速脱水炭化。沸点:339，用于有机组织、氢氧化物、合金、金属和矿石。
6、采用玻璃或石英容器可扩大硫酸的适用温度范围。应用于敞口微波消解系统如美国公司的Ta系统采用玻璃或石英容器。,HClO4是一种强氧化剂，能与其他酸不反应的金属反应，也能完全分解有机物，然而当热高氯酸与有机物及容易氧化的无机物接触时，可能会产生爆炸，因为高氯酸在微波系统的密闭容器中加热时经历了一个不可逆的分解反应，产生一种气态最终产物造成压力迅速上升，形成潜在的威胁。慎重使用。H3PO4热磷酸成功的用于那些用盐酸消解时会使某些特定痕量组分挥发损失掉的铁基合金。磷酸除了可消解铁基合金，还可溶解许多铝炉渣、铁矿石、铬及碱金属。,BF4四氟硼酸用于那些需要分解硅酸盐和需高温条件的含有无机基体的地质样品的
7、消解。在227的密闭容器中其分压仅为57atm，不需高压就可得到比氢氟酸更高的温度，且酸并不分解。硅酸盐、地质样。HF适用于彻底消解含硅样品。,HCl:HNO3(王水)用于无机物如金和铂的消解。植物组织和废水也通常用此混合酸消解。王水能从硅脉石中滤去金属但不能使其全部溶解。HNO3:H2SO4得益于硫酸盐的络合物的形成及高温下脱水和氧化的性质。一般体积比1:1。起始反应后加入过氧化氢可使反应完全，但须当液体体积减少至可看到SO2烟雾时才加入。适用于聚合物、脂肪和有机材料,HNO3:HF一般体积比为HNO3:HF=1:5，溶解Ti，Nb和Zr(除ZrO2)。合金、碳化物、氮化物、硼化物、硅酸盐岩
8、石、灰、矿渣和高硅含量的植物材料可用此混合酸消解。,过氧化氢:如果HNO3消解食物或类似样品后仍有残余有机物存在，可以加入过氧化氢，但应小心从事。过氧化氢必须在预处理阶段和低功率条件下(250)进行辅助，或在主要有机物质被消解后才能加入。需要炭化的样品须在密闭容器消解操作的后期蒸发掉硝酸和水，然后加入过氧化氢彻底消解有机物质。硝酸和水蒸发到产生浓白的SO2烟雾为止。过氧化氢应逐滴加入，直到溶液变清为止。,HNO3:HCl:HF通常方法是制成逆王水(HNO3:H体积比3:1)，然后再和H以7:3的体积比混合。另一种比例为HNO3:H:H体积比为5:15:3。用于消解合金、硅酸盐岩石、灰、矿渣、粘
9、土、玻璃和一些陶瓷。H2SO4:H3PO4比例为1:1用于消解,样品使用量原则,有机样品样品：机样品应限制到0.52g物质/容器，取决于样品有机物的含量的高低。如石油属重有机物，安全限不能超对于陌生样品从0.10.2g开始逐渐增加到0.5g，这将防止样品消解过程中过量气体副产物的积累。无机样品量：限制在10g物质/容器。典型的限制因素是消解/萃取品所需酸的量。有机-无机混合样：如果样品中含有5%以上有机物时，需把此样品视为有机物，并依据有机物的处理方式来消化整个样品。,温度/压力使用原则,温度不超过250 压力（视仪器的质量，一般不超过20atm),典型微波消解操作：,硝酸-盐酸消解：称取12
10、干试样置于消解罐中，加入10mL硝酸和5mL盐酸，旋紧罐盖，静置一夜以防加热反应过分激烈，然后，按下列步骤在微波炉中进行处理：30%全功率4min50%全功率4min100%全功率4min。将样品罐静止冷却至室温，开盖，浓缩至2mL，在25mL容量瓶中用去离子水稀至刻度。,硝酸-氢氟酸-双氧水消解：称取干试样12置于消解罐中，加入硝酸10mL和50%HF3mL，静置一夜，然后，在微波炉中按以下步骤处理：30%全功率4min60%全功率4min100%全功率2min40%全功率5min。冷却后，加入30%的H2O210mL，将溶液在微波炉中浓缩后转入25mL容量瓶中，稀至刻度。过滤沉淀后，待测。
11、,（一）植物氮的测定,待测液制备方法开氏消化；硫酸-双氧水法测定方法蒸馏法。纳氏比色法。靛酚蓝比色法。碱解扩散法（康惠皿法）氨气敏电极法。甲醛法,（二）植物磷的测定,待测液制备方法硫酸-双氧水；硫酸-高氯酸。测定方法钼蓝比色法钼黄比色法,（三）植物钾的测定,待测液制备方法硫酸-双氧水；硫酸-高氯酸；灰化法；6M盐酸浸提法。测定方法火焰光度法。,（四）植物钙、镁的测定,待测液制备方法硫酸-双氧水；硫酸-高氯酸；灰化法；硝酸-高氯酸-盐酸测定方法AAs法；（注意阴离子的干扰）ICP法；EDTA络合滴定法。,（五）植物硼的测定,待测液制备方法灰化法或碱熔法；测定方法甲亚胺比色法；姜黄素比色法。邻二杂
12、菲镉缔合/硝基苯萃取原子吸收法,硼的测定邻二杂菲镉缔合/硝基苯萃取原子吸收法,1、方法原理 硼虽可用无火焰-AAS法测定，但在石墨炉中易形成碳化硼难于原子化而降低了其测定的灵敏度。在硫酸的介质中，用氟化铵将样品消解液中的BO33-转化为BF4-，然后使之与Cd(phen)32+三（1,10-含邻二氮菲）镉离子缔合，反应如下：以硝基苯萃取，在空气-乙炔火焰中，用AAS法测定镉的含量从而间接测定硼的含量。,2、试剂,Cd(phen)32+溶液：取2mg/mL Cd2+和5mg/mL邻二氮菲配成100mL溶液；500mg/L KBF4溶液液和1.25mol/L NH4F溶液；1/15mol/LKH2
13、PO4-1/15molNa2HPO4缓冲溶液(pH=4.9),3、操作称植物样12g至消化杯，加浓硝酸15mL,高氯酸2mL，稳定剂高锰酸钾0.01g，微波消解制成待测液。取适量待测液加1.25mol/L NH4F溶液和浓硫酸各5mL，80加热30min，置于分液漏斗中，加入pH=4.9缓冲液10mL，摇1min，加Cd(phen)32+溶液0.7mL充分混合，用硝基苯5mL萃取3min，取有机相于228.2nm处AAS测定镉，然后计算硼的含量。,3、方法评述,可用MIBK、三氯甲烷或乙酰丙酮等作为萃取剂；对植物样品消解处理后的常见离子进行实验表明，因萃取体系控制pH值在5.0左右，Al3+、
14、Fe3+大部分沉淀分离；Na+、K+、Ca2+、Mg2+也不能取代Cd(phen)32+中的Cd，因而很难进入有机相中；F-、C1-、NO3-、ClO4-、SO42-、C032-、PO43-等虽有与Cd(phen)32+缔合趋势，但在萃取条件下，络离子的空间构型迫使变形性大,不易与Cd(phen)32+缔合，或优先进入有机相，致使共存离子达不到干扰。测定有机相中的吸光度，硼的特征浓度为0.016g/mL1，线性范围是0.005-1.20 g/mL。,硼的测定荧光法,硼荧光分析多在强酸介质或有机介质中进行，且灵敏度和选择性不够理想，有的反应时间较长、试剂稳定性差。方法原理：在近中性的水介质中，2
15、-(5-甲基-2-胂酸基苯)偶氮-1,8-二羟基-3,6-萘二磺酸(简称5-MAsA-I)与硼形成在紫外光区强荧光物质，络合反应时间短（35min形成），试剂及络合物稳定时间长、选择性和灵敏度均较好，可直接植物样品中微量硼的测定。水定容,于ex=235nm，em=367nm处,测定溶液的荧光强度。,在25mL比色管中依次加入0.5mmol/L荧光试剂（5-MAsA-I,水溶液）2.0mL，pH6.7的磷酸氢二钠-磷酸氢二钾缓冲溶液5.0mL和一定量的标准硼溶液或样品试液，以二次蒸馏水定容，于ex=235nm，em=367nm处,测定溶液的荧光强度。,操作步骤,测定的要点,酸度对荧光强度的影响：
16、在 pH6.7的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾为反应的缓冲介质，络合物在pH6.37.3范围内,荧光强度最大且稳定。缓冲剂用量的影响：缓冲剂用量在37mL范围内,荧光值基本不变。荧光试剂用量：不足则反应不完全,过大则荧光猝熄灭，在试验条件下,在13mL范围内荧光强度基本不变。荧光配合物稳定性：35min完成反应且至少稳定5h。络合物组成比为BR=12。线性范围：02ppm。,硼的诊断指标,甜菜硼的诊断：极度缺硼(B，18 mgkg-1)；供应中等(B，1830 mgkg-1)；供应充足(B，30 mgkg-1)。甘蓝型油菜的硼诊断：严重缺硼(B，5 mgkg-1)；明显缺硼(B，58 mgkg-1)；
17、不缺硼(B，10 mgkg-1)。,（六）植物锰的测定,待测液制备方法灰化法；酸溶法。测定方法AAs法或ICP法；高锰酸钾比色法。,植物锰的诊断指标,燕麦、小麦为15 mgkg-1，大豆为20 mgkg-1，大麦为15 mgkg-1，亚麻、胡萝卜、苜蓿为15 mgkg-1，甜菜为10 mgkg-1，豌豆为8 mgkg-1。注意植物在不同发育时期以及不同部位的差异。,（七）植物铜、锌的测定,待测液制备方法：灰化法；酸溶法。测定方法：AAs法或ICP法；诊断指标铜柑桔叶片6 mgkg-1；梨、苹果叶片5 mgkg-1；桃7 mgkg-1。苜蓿全株10 mgkg-1；大豆新成熟叶片为10 mgkg-
18、1；棉花新成熟叶片为8 mgkg-1；玉米开始吐絮时的耳叶为5 mgkg-1；大、小麦叶片为6 mgkg-1；水稻稻草的含铜浓度为6 mgkg-1。,锌少于15 mgkg-1，可能发生缺锌现象；少于24 mgkg-1可能对锌肥有良好反应。一般作物含锌少于15 mgkg-1时，可能对锌肥有良好反应,（八）植物钼的测定,待测液制备方法：灰化法。测定方法：硫氰酸比色法；极谱法；无火焰AAs法或ICP法；二甲氧基经基苯基荧光酮光度法,钼的测定二甲氧基羟基苯基荧光酮光度法,方法原理：表面活性剂2,3,7三羟基荧光酮类试剂(如水杨基荧光酮、苯基荧光酮、二溴苯基荧光酮、二溴羟基苯基荧光酮、邻羟基萘基荧光酮等
19、）与钼形成配合物，其显色反应灵敏度较高，选择性较好，可用光度法测定钼的含量。荧光酮试剂二甲氧基羟基苯基荧光酮(DMHPF)，学名是2,3,7-三羟基-9-(3,5-二甲氧基-4-羟基)苯基荧光酮，其结构式为：,并利用Mo6+-DMH-PF-Tritonx-100三元体系，形成与钼的显色反应，建立了测定痕量钼的方法。在硫磷混酸(H2SO4酸度0.04l-0.086mol/L)介质中，形成钼/试剂=1：1的红色配合物，最大吸收锋526nm，表观摩尔吸光系数为1.2510mol/L/cm，钼含量在0-8g/25m1范围内符合比耳定律。反应的选择性较其他荧光酮试剂有所改善，特别是三价铁的允许量可高达1
20、75mg/mL，而且钒、钨、钴等的允许量也有所提高。方法简便、快速、准确，用于样品中钼的测定获得满意结果。,仪器与试剂,722型分光光度计硫磷混酸溶液：分别取硫酸24mL，磷酸80mL，用水稀至500m1。二甲氧基羟基苯基荧光酮（DMH-PF）溶液：0.4g/L，称取DMHPF 0.0400g，加3mol/L H2SO4 7mL，乙醇20m1搅拌溶解，加少许乙醇稀释移至100mL容量瓶中，用95乙醇定容。50g/L tritonx-100溶液。,操作步骤,称取适量植物样品，加浓HNO3 10ml浸泡24h后低温消解至剧烈反应完毕，再加硝酸-高氯酸混酸(2：1)10-15mL，蒸至近干，用稀Na
21、OH调pH近中性后，定容得待测液。移取一定量待测液(钼8g)于25mL容量瓶中，依次加入硫磷混酸溶液2.0mL，50g/L tritonx-100溶液5.0m1，DMH-PF溶液2mL，水定容，以试剂空白为参比，用1cm比色皿，于分光光度计526nm波长处测定吸光度。,方法评述,酸度试验用硝酸、盐酸、硫酸和磷酸体系，Mo6+-DMH-PF-Tritonx-100的显色反应均可进行，但单独使用少量磷酸时，试剂空白稳定性欠佳，20min后溶液颜色加深且出现浑浊现象。适宜H+为0.07mol/L。显色时间及配合物的稳定性与DMHPF立即显色，体系的吸光度即达最大且恒定，至少24h内无明显变化。配合物
22、的组成：Mo：DMH-PF1：1。干扰试验当测定误差不超过土5%时，以下离子的允许量(以mg计)为：NO3-(410)，SO42-(250)，Fe3+(175)，C1-(150)，K+(55)，Na+、NH4+(50)，Zn2+(45)，Cu2+(30)，柠檬酸(25)，酒石酸(20)，Mn2+(12)，Mg2+、Ni+(10)、A13+(7)、草酸(05)。,植物钼的诊断指标,一般为0.1-0.5 mgkg-1。三叶草顶部0.5mgkg-1；苜蓿0.28mgkg-1；甜菜0.05mgkg-1；大、小麦为0.03 mgkg-1；甜玉米0.09 mgkg-1；棉花0.5mgkg-1；烟草0.13
23、 mgkg-1等。植株含钼的致毒量，有的高达几百mgkg-1也不一定表现中毒，但超过15 mgkg-1，作饲料可使牲畜中毒。,一、荧光分析的基本原理,当用某一种波长的光照射某种物质时，该物质能在极短的时间内发出较照射波长稍长的光，这种光称为荧光。能发出荧光的物质称为荧光物质，用来照射物质使之发出荧光的光称为激发光。不同的物质所发出的荧光的波长不同，所需要的激发光的波长也不同，这个特性可用来鉴别物质进行定性分析，同一物质在一定条件下所发出的荧光的强度与浓度有关，据此可进行物质的定量分析，这种利用物质的荧光特性进行定性定量分析的方法称为荧光光谱法。所用仪器有荧光计和荧光分光光度计。,根据所用激发光
24、及所发生荧光波长的不同，分为：X光荧光、紫外光荧光、可见光荧光红外光荧光等。一般所称荧光及荧光分析是指研究和利用比较多的用紫外光作激发光的紫外荧光或可见荧光。,(1)荧光的产生,当光进入某种物质后，光的能量可能有一部分或全部被物质分子吸收，这些分子的电子则从基态跃迁至能级较高的激发态，如第一电子激发态或第二电子激发态。跃迁以后，能量较大的激发态分子通过内转换过程把部分能量转移周围分子，自己回到第一电子激发态的最低振动能级，如图中V=0级。这些分子可能通过发射出相应光子的方式来释放能量而回到基态的各个不同振动能级，这些光子称为荧光。,(2)荧光光谱法的特点,a灵敏度高 与其他分光光度法相比较，荧
25、光分析是从与入射光成直角的方向检测荧光发射光，因此是在暗背景下检测荧光发射。而其他分光光度法是正对入射光方向检测样品对入射光的吸收，因此是在亮背景下检测暗线吸收光谱。因此前者可通过使用亮度更强的激光源的方法大大提高灵敏度，而后者则受到背景干扰的限制。所以荧光法比其他光度法灵敏度要高23个数量级。,b选择性强,荧光光谱包括激发光谱和发射光谱，而其他光度法只能得到物质的吸收光谱，因此后者当两物质的吸收波长很接近时则不易分开。而荧光法既能利用物质的吸收光谱也能利用物质的激发光谱来鉴别物质，因此荧光法有两个光谱的双重选择，有更高的选择性。假如某两种物质的吸收光谱很相似，则可利用激发光谱区别它们。而两种
26、光谱都很相似的物质的数量较吸收光谱很相似的数量大大减少。,其他光度法仅能提供样品的吸收光谱，而荧光法可提供包括激发光谱、发射光谱、荧光强度、总荧光量、荧光效率、荧光偏振、荧光寿命和斯托克斯位移等许多物理参数，可取得有关分子结构和样品浓度的更多信息，这是其他光度法所不能比拟的。近年来荧光分析在理论上和应用上都取得了重大进展，除在医学、药学和生物学等方面外，在农业、环保和食品加工等方面也都有广泛应用、荧光法已成为超微量分析中不可缺少的工具。,c能提供更多的信息,（3）荧光光谱的基本内容,a激发光谱 用波长连续变化的单色光照射荧光物质使之发光，而后让其产生的荧光通过波长固定的单色器照射到检测器上，由
27、检测器检测出荧光强度，得到以激发光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标的光谱图，称为激发光谱。激发光谱中有一个或数个峰值，称为激发峰。激发峰所对应的波长为激发波长，在一定条件下物质的激发波长仅与物质分子结构有关，因此激发波长可作为对物质定性的依据之一。,未经校正的仪器测得的激发光谱称为表观激发光谱，它实际上是样品本身的激发光谱与仪器的光源、单色器、检测器等光学器件的光谱特性的迭加。由于不同仪器的性能不同，因此不同仪器测得的表观光谱不能互相比较，必须从中扣除仪器本身的光谱特性，取得样品本身的激发光谱，这一过程称为光谱校正，所得到的光谱称为样品的真实激发光谱。,b发射光谱,当用某一固定波长的单色光照射
28、样品，而让其产生的荧光通过波长连续变化的单色器时，所得到的以荧光发射波长为横坐标、荧光强度为纵坐标的荧光谱图，称为发射光谱。发射光谱中的峰值称为发射峰，其波长称为发射波长。发射波长与激发波长一样也是鉴别物质的依据。同时与激发光谱一样，发射光谱也有表观发射光谱与真实发射光谱之分，实验中也须首先对仪器进行发射光谱校正，才能得到物质的真实发射光谱。,除个别物质例外，物质的真实发射光谱的形状与激发波长的选择无关，但用不同的激发波长所得到的发射光强度不同。用激发波长时所得到的发射光强度最强，越是远离激发峰的波长，所得发射波长越小。反过来，物质的真实激发光谱的形状和强度与发射波长的选择也有相似的规律。,c
29、荧光强度及荧光总量,荧光强度是指荧光物质在一定强度的紫外光照射下所发出的荧光的强度。荧光强度与仪器性能、激发光强度及样品浓度、样品发射荧光效率等有关，因此荧光强度的绝对值不易测量，大多数荧光分光光度计都用相对荧光强度来表示样品发射荧光的强弱。荧光强度无量纲。荧光物质的稀溶液的荧光强度与其浓度成正比，因此可用荧光强度进行定量分析。,当不用某一波长的荧光来表示某物质发射的荧光强弱，而用该物质的发射光谱的面积来表示荧光的强弱，称为总荧光量。一般在滤光片式荧光计上测得的读数即为样品的总荧光量。荧光分光光度计上直接测得的是荧光强度，而总荧光量则可通过对波长积分求得。用总荧光量定量可进一步提高检测灵敏度。
30、,二、荧光光谱法定性定量方法,(1)定性方法 由于荧光光谱的形状和荧光峰的位置对于荧光物质是有其特征的，因此可利用其特征激发波长和特征发射波长作为定性依据。荧光法定性常采用直接比较法，即将未知样品与已知标准物质在相同的测试条件下测定其激发光谱和发射光谱，然后加以比较，鉴定是否为同一物质。,(2)定量方法,a荧光强度与溶液浓度的关系 荧光是由物质在吸收光能之后发射出的，溶液发射荧光的强度与诸有关因素的关系可用下式表示：F=I0CLF_溶液的荧光强度_荧光物质的荧光效率I0_激发光强度_吸光系数(与溶液性质及仪器性能有关)C_样品液浓度L_液层厚度(样品池厚度)上式说明：对于某一荧光物质的稀溶液，
31、在一定波长和一定强度的激发光照射，以及其他仪器条件和环境条件一定的条件下，荧光强度与溶液中荧光物质的浓度成正比。,b荧光定量分析的方法,上式即荧光定量分析的依据。与吸收光谱法中的郎伯比耳定律基本一致。目前，荧光 光谱法大多用于荧光物质的定量分析，分析方法与吸收光谱法基本相同，吸收光谱法中的标准曲线法、对照计算法、列解联立方程法、双波长法及导数法、差示光谱法等均适用于荧光光谱法。,(3)荧光分析的干扰因素,a溶剂的影响 选择适宜的溶剂 所用溶剂不应在紫外光范围有光吸收，如苯、丙酮、酚等，就不宜在紫外光范围使用。另应注意同一荧光物质在不同溶剂中荧光光谱的形状和强度也有显著不同。例如硫酸奎宁在硫酸中
32、有荧光而在盐酸中无荧光。溶剂应有足够的纯度 溶剂中的杂质会干扰待测样品的荧光，或使其增强，或使其减 弱，影响定量准确性，必要时需对溶剂加以处理。例如：乙醇可加氢氧化钾蒸馏，正丁酸、正庚烷、二氯丁烯、乙醚等可用o1M盐酸和01M氢氧化钠洗后再用水洗，无离子水有时也有荧光，应用二重或三重蒸馏水。,b实验用具的影响,润滑油有很强的荧光，注意使用分液漏斗等带活塞的器具的，活塞上不要涂油。橡皮塞和软木塞也是荧光污染源，使用时应包以锡纸。洗涤剂有时也有很强荧光，重铬酸钾洗液也有紫外吸收，因此在洗涤器皿时应冲洗干净，然后再用半浓硝酸煮沸后漂洗，再在蒸馏水中煮沸。,c温度的影响,温度对溶液的荧光性质有显著影响
33、，一般来说，溶液的荧光强度随温度的降低而增强。因为温度降低时介质粘度增加，因荧光物质分子与溶剂分子的碰撞 而引起的非辐射能耗减少的缘故，所以在荧光分析中一定要保持样品环境温度的稳定。,d溶液pH值的影响,溶剂pH值的变化对荧光强度有很大影响。因为大多数芳香性荧光物质都带有酸或碱基因，因此它们对pH的变化很敏感。例如苯酚可视为弱酸，它在酸性溶液中以分子形式存在，呈现荧光，但在碱性溶液中则以苯酸阴离子形式存在而不发荧光。所以在荧光分析中严格保持溶液的pH值十分重要。,e荧光淬灭,荧光淬灭是指由于荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作 用所引起的荧光强度降低的现象。荧光溶液浓度过大时，也常发生
34、自淬灭现象，使荧光强度与试样浓度的关系曲线向下弯曲而失去线性关系，所以在测试浓溶液时应注意检查线性范围。,f光分解,荧光物质大多对光很不稳定，特别在稀溶液中，在自然光或强激发光源照射下，光敏感物质的光分解很明显。在荧光测量期间时间稍长荧光读数就会慢慢下降，甚至荧光峰也产生位移。因此在测定光敏物质时，最好使用弱光源，在样品有多个激发波长时尽量使用波长较长的低能量激发光。在测定时要注意及时关闭光闸，尽量缩短测定时间。在制样过程中应尽量避免光照，尽量在暗室操作或将样品包以黑纸。荧光分析十分灵敏，干扰因素也较多，很多细节注意不到，都可能导致实验失败。,三、荧光仪器的基本构成,1.激发光源,常见的紫外一
35、可见区激发光源有钨灯、氘灯、汞灯、氙灯等，激发光源应有足够的光强度和稳定性。目前大多数荧光分光光度计均采用高压氙灯作为光源，因为氙灯能在紫外一可见提供较好的连续光谱，缺点是稳定性较差，需要性能较高的电源。,2.单色器,目前大多数荧光分光光度计都采用衍射光栅单色器。荧光分光光度计有两个单色器，激发单色器和发射单色器，前者用于从复合光源中选出单一波长的激发光，后者用于从复合荧光发射光中选出单一发射波长。,3.样品池,荧光分光光度计所用的样品池与紫外光度计类似，有玻璃池和石英池两种，前者用于可见光，后者用于紫外光区。,4.检测器,目前大多数荧光分光光度计均采用灵敏度较高的光电倍增管作检测器。,四、荧
36、光分光光度计的工作原理,氙灯光源的发光 单色器样品池样品被激发 荧光经滤光片和发射单色器荧光检测器荧光强度电信号中央处理机信号输给记录仪绘出谱图或直接在荧 光屏显示。初始化设置阶段，插入镜插入光路，光线进入激发单色器，又穿过束分裂器，汞灯的一部分光经光导纤维束进入发射单色器，汞灯的某个线光谱被用于波长和光谱带通校正。经束分裂器分裂的汞灯的另一部分光被导入监视检测器，监视检测器的输出信号沿荧光检测器相同的路径送记录仪记录。,五、仪器校正,1.激发光谱校正 目的：扣除激发光源和激发单色器的光谱特性的影响，取得样品的真实激发光谱。目前大多仪器利用荧光物质罗丹明B的浓溶液的荧光发射来校正激发光谱。基本
37、原理:罗丹明B的荧光强度只随激发光强度变化而不随激发光波长而变化，即其发射光谱的形状与激发光的光谱形状相同。如日立850荧光计就是先对罗丹明B溶液进行激发光谱扫描，计算机自动将罗丹明B的发射光谱记忆下来，然后从样品的表观激发光谱中扣除。得到样品的真实光谱。,2.发射光谱校正,目的：扣除发射单色器和光电倍增管的光谱特性的影响。日立850荧光分光光度计是采用将激发光直接引入发射单色器的办法。将一专用的散射器插在样品架上，激发光经散射器散射到发射单色器上，令激发侧和发射侧同时扫描，检测器检出包括激发光光谱在内的发射侧光谱(后者反映了发射单色器和光电倍增管光谱特性)，再从中扣除激发光谱即得到发射侧光谱
38、。计算机将其记忆下来，再自动从样品的表观发射光谱中扣除之，即得样品的真实发射光谱。,2.波长检查,新安装经较长期使用的仪器，及更换了光学部件的仪器需进行波长检查，以核对波长读数与真实值是否一致。利用线性光源汞灯的已知标准谱线。汞灯有13条波长准确不变的谱线（如43583nm和546nm），检查激发单色器和发射单色器的波长精度。检查时，先调出波长检查程序，此时仪器自动在光路中插入一插入镜将氙灯光线挡住而将专用于校准的汞线引入激发单色器，然后由光束分离器直接引入监视检测器(不经样品室和发射单色器)，从545nm开始作546nm附近的光谱扫描，监视检测器测得的激发光谱信号送计算机处理，核对荧光屏上显
39、示的峰值波长应在54.0702nm以内。,六、仪器参数的选择,1激发单色器和发射单色器狭缝宽度的选择狭缝宽度表示方法：带通：用狭缝实际宽度表示，单位为mm。带宽：用谱带波长范围表示，单位为nm。日立850用带宽表示，可供选择的范围是020nm。,特点：狭缝宽度较大时，透过光强度较大，灵敏度较高，但分辨率较低；狭缝宽度较小时，透过光强度较小，灵敏度较低，但分辨率较高。定性分析选择较小的狭缝宽度；定量分析选择较大的狭缝宽度。在作激发光谱扫描时为得到激发光谱线细节，同时兼顾光强度，可选择较小的激发侧狭缝宽度和较大的发射侧狭缝宽度；同理，在作发射光谱扫描时则选择较大的激发侧狭缝宽度和较小的发射侧狭缝宽
40、度。分析一些易产生光分解的物质时，为减弱其光分解作用，可选择较小的激发狭缝和较大的发射狭缝。,2.光电倍增管电压,光电倍增管电压较高时，灵敏度较高，但同时暗电流和噪音也增加，而且光电倍增管寿命降低。所以在灵敏度足够时应尽量选择较低的电压。仅在确需高灵敏度时才选择较高电压，且必须在规定允许范围内。日立850荧光分光光度计的光电信增管电压有低、中、高三档可供选择。,3.响应速度,响应速度是指仪器检测系统输出信号达到输入信号最大值的98时所需的时间。响应速度快时，可得精细谱线结构，但谱线杂峰较多，用于需要高分辨率的场合。例如日立850荧光分光光度计的响应速度有05s、2s，6s三档可供选择。,4.滤
41、光片的选择,滤光片在滤片式荧光计中作单色器使用，在光栅式荧光分光光度计中用以滤除不需要的杂散光。日立850荧光分光光度时装有五种用于不同波长的短截止滤光片，作为发射滤光片，其截-止波长分别为290、310、350、390和430nm。使用时应注意选择其截止波长比所使用的波长短的滤片。,硒含量的测定,概述,硒是对人、畜及许多植物有重要生理作用的微量元素。植物中硒的含量一般在0.052ppm间。含量因作物种类、产地和加工方法而不同，海产品含硒量较高，蔬菜和水果的含硒量较低。,当食物中含硒量超过5mgkg时，可引起硒中毒;长期食用缺硒食物时，能引起白肌病等地方病，心脏病发病率提高，著名的克山病是因为
42、缺硒引起的，一定量的硒能提高人机体免疫能力，有抗肿瘤、抗癌等作用。,测定方法2，3二氨基萘荧光分光光度法：该法灵敏度高，干扰少，检出限可达0.006ppm，被称为标准分析方法。氢化物发生原子吸收分光光度法氢化物分离邻菲罗啉铁分光光度法3，3，二氨基联苯胺比色法气相色谱法极谱催化波法紫外分光光度法等,1.方法原理样品经消煮破坏有机物后，使硒化合物转化为四价态的亚硒酸(H2SeO3)。在酸性条件下，硒与2，3二氨基萘作用，生成4，5苯并硒二唑，在紫外光照射下会发生黄色荧光反应：,一、2,3-二氨基萘荧光法,用环己烷萃取反应生成的4，5苯并硒二唑，用EX=366nm，EM=520560nm，以荧光计
43、测定样品中硒的含量。在萃取前加入EDTA稳定剂，可消除其他金属离子的干扰。,2试剂,0.1N盐酸溶液；1：1甲酸溶液，环己烷。稳定剂：含有10盐酸羟胺的0.04MEDTA-2Na溶液。2,3-二氨基萘溶液；将2,3-二氨基萘0.100g溶于100ml含有0.5g盐酸羟胺的0.1N盐酸中，在50度加热30min，并不断地摇动，用20ml环己烷萃取。离心分离收集水相，棕色瓶中冷存。（此步骤以及以后的2，3-二氨基萘处理的操作都应避光进行）0.1g/mL硒标准溶液：称取0.1634g亚硒酸(H2SeO3)溶于1000ml重蒸馏水中，取此溶液1.0mL用0.1N盐酸稀释至100ml制得。,3操作步骤,
44、待测液制备 用硝酸-高氯酸消化法制得。比色测定 将消煮液加0.1N盐酸2ml沸水浴中15min使硒酸盐还原成亚硒酸盐 加1：1蚁酸和稳定剂各5ml 以4N氢氧化铵调节pH=18加0.12，3-二氨基萘溶液5m1 50水浴中加热30min并不时摇匀冷却后加环己烷5ml 振荡5min，静置后除去水相用 0.1N盐酸25ml洗涤环己烷溶液弃去盐酸溶液环己烷溶液通过无水硫酸钠过滤于小试管中在EX=366nm，EM=520nm下测定其荧光强度。分析同时作空白试验。标准曲线绘制 取0.1g/mL硒标准溶液0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25mL,其它操作同样品。,4.计算,式中：C标准曲线
45、查得的浓度(gmL)V环已烷萃取液体积(m1)W称样量(g),硒（g/g）=C V/W,5.注意事项,（1）酸度对荧光强度、荧光波长以及达到最强荧光时所需的时间都有一定的影响。硒与2，3-二氨基萘反应和萃取的最适酸度为pHl.52.0之间。（2）荧光强度和浓度的线性范围一般较窄，浓度太高，由于浓度猝灭，内滤光效应及荧光的再吸收等原因，荧光强度反而降低，造成误差。所以应注意将样品溶液浓度控制在标准曲线的线性区。（3）因为环己烷挥发性强，可以在其萃取液收集完后立即将塞塞紧。（4）样品消煮时注意硒的损失（温度控制在100左右）。,1.方法原理硼氢化钾在酸性溶液中(1.5-4.0N盐酸浓度)使硒(IV
46、)还原成 H2Se挥发分离出来，经邻菲罗啉铁()溶液吸收，H2Se再还原邻菲罗啉铁生成橙红邻菲罗啉亚铁，其颜色深度与硒的浓度在一定范围内成正比。,二、邻菲罗啉铁比色法,主要仪器,2试剂,硒标准溶液。3硼氢化钾溶液；称取3g硼氢化钾溶于 0.5KOH水溶液100m1中，滤去不溶物，贮于聚乙烯瓶中。硒化氢(H2Se)吸收液：在醋酸醋酸钠缓冲液50ml中加入0.2邻菲罗啉溶液75m1及含Fe2+mgml的硫酸铁铵溶液5m1，加水至500m1。pH4的醋酸醋酸钠缓冲液：02M醋酸钠18ml与02M醋酸82ml混合即成。20亚铁氰化钾溶液(WV)。5N盐酸溶液。,3操作步骤,待测液制备 用硝酸-高氯酸消
47、化法制得。荧光强度测定 510ml置于反应瓶中，加 20亚铁氰化钾溶液lml及 5N HCl溶液15ml，加水至30ml，接好发生装置，通气34min后，再接上吸收管，从筒形加液漏斗中加入KBH4溶液20ml，在V型玻璃吸收管中装入70mL吸收液，按图连接好装置，在筒形加液漏斗中加入KBH,溶液20ml，盖好塞子，通氮气(或用打气球打气)加压，缓缓开启活塞，让KBH4溶液在3.54min内全部加到反应瓶中，控制加入速度以保持吸收液气泡升至吸收管半球部为宜。加完后，鼓气约lmin，有助于将可能残存的H2Se自反应液中带出。吸收完后，于25室温下放置15min，显色可达稳定，在508nm下测定吸收
48、液的吸光度。标准曲线绘制 同样品作0-10 g硒标准系列。,4.计算,式中：C标准曲线查得的硒量(g)50样品液体积(m1)W称样量(g),硒（g/kg）=50 C 1000/W,5.注意事项,（1）大部分离子不干扰硒的测定。Cu2+和Fe3+(大于1mg)的干扰可直接在反应瓶中加入铁氰化钾溶液生成沉淀而掩蔽。（2）反应液中KBH4量在0.4-0.7g时，吸收值有较稳定的最大值。吸收完后，于25室温下放置15min，显色达到稳定，能保持24h不变。,1.方法原理在微酸性条件下，硒与3，3，二氨基联苯胺反应生成黄色苤硒脑络合物，反应式如下；,三、3，3-二氨基联苯胺比色法,苤硒脑在中性溶液中可被
49、甲苯或二甲苯等有机溶剂较好地提取，在420nm时有最大吸收，当硒的浓度在110 gml甲苯范围内时，符合比耳定律，添加EDTA可防止铁，铜和其他金属元素的干扰。,2试剂,5EDTA2Na溶液；5NaOH溶液，1：1 HCl溶液，0.53，3，-二氨基联苯胺溶液，硒标准液：,3操作步骤,待测液制备 用硝酸-高氯酸消化法制得。比色测定取510ml样品待测液，置于分液漏斗中，加水至总体积为35ml。加入5EDTA2Na溶液lml，摇匀，并用1：1 HCl调节溶液pH23左右，各加入053，3，二氨基联苯胺溶液4ml，摇匀，置于暗处30min，再用5NaOH溶液调节至中性。加入10mi甲苯振摇2min
50、，静置分层，弃去水层，甲苯层通过棉花栓过滤于比色皿中，置于分光光度计420nm波长处测吸光度，标准曲线绘制 同样品作0-10 g硒标准系列。,4.计算,式中：C标准曲线查得的硒量(g)50样品液体积(m1)W称样量(g)V 用于比色测定的样品液体积(m1),硒（g/kg）=50 C/W,5.注意事项,（1）3，3二氨基联苯胺易氧化变质，因此该溶液需临用时配制。（2）加甲苯萃取后如有乳化现象，可加入几滴无水乙醇，摇动，澄清后过滤。,碘的测定,碘的作用与含 量,碘虽然对植物不是必需的元素，但对人类和动物是不可缺少的元素。甲状腺肿和甲状腺机能亢进症，是分别由于碘的缺乏与过剩引起的。而人体和动物体中的
