第十五章基因重组与基因工程.ppt

《第十五章基因重组与基因工程.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第十五章基因重组与基因工程.ppt（62页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、第十五章 基因重组与基因工程,思路：定义 基因重组 意义（自然）方式：接合、转化、转导、转座基因重组 类型 定义 基因工程 意义（人工）基本要素 原理 临床,第一节 自然界的基因转移和重组,一、定义：基因重组：指细胞基因组中DNA顺序重新 排列组合的现象。二、意义：基因变种、物种演变、进化的基础三、方式：接合 转化 转导 转座,1接合:指供体细胞（细菌）和受体细胞（细菌）接触，使DNA从一个细胞转移到另一个细胞 的过程。.例:较大质粒在细菌间的转移2转化：指外源DNA被引入细胞，导致其遗传和生 物性状改变的过程。方式：自动获取外源DNA 基因重组（自然）人为供给外源DNA 基因工程 例：细菌抗

2、药性3转导：以病毒为媒介、将供体菌的DNA片段转移到 受体菌基因组的过程。例：噬菌体感染宿主菌,4转座：指可移动的DNA序列（游动基因）从基因组的 一处移动到另一处 的过程。游动基因 介导形式 保守性转座 复制性转座 种类 插入序列 转座子 a.插入序列：转座酶基因反向重复序列 b.转座子 定义：可从染色体一个位点转移到 另一位点的分散的重复序列。结构：插入序列特殊序列（e.g:抗性基因）,四、类型,位点特异重组:由整合酶催化，在两个DNA 序列的特异位点间发生的整合。2.同源重组(基本重组)定义：发生在同源序列间的重组。(依赖DNA间同源性，不是特异性)机制：a.产生中间体 b.分解中间体,

3、第二节 基因工程（重组DNA技术）,一、定义：指在体外用人工（酶学）的方法，将目的基因与载体DNA重组，并把重组体DNA导入宿主细胞，使目的基因扩增和表达的技术。也称：重组DNA、重组DNA工艺学、DNA克隆、基因克隆、重组DNA技术。克隆（clone）：指由同一个始祖经过无性繁 殖所形成的副本或拷贝集合。克隆化：获得同一拷贝的过程。,二、意义 扩增基因、生产蛋白、创造新种,三、基本要素 酶 目的基因 载体基因 宿主,（一）、工具酶 限制性核酸内切酶 定义：识别DNA的特异序列,并在识别 位点或其周围切割DNA双链的 一类内切酶.分类：I、II（常用）、III类 命名 II类酶 特点 识别点是

4、DNA回文结构 切割方式 粘性末端 5粘端 3粘端 平头末端 配伍末端 识别点不同，末端相同,（二）、目的基因 定义：是指所要研究或应用的基因。类型：cDNA（互补DNA）基因组DNA 来源:化学合成（人工合成）基因组DNA文库(全部基因组DNA的集合)cDNA文库(含全部mRNA信息)PCR（聚合酶链反应）,PCR:指在反应体系中加入模板、dNTP、引物、DDRP和缓冲液；经多次（25-30）变性、退火、延伸循环反应；使目基因扩增（指数增长）的过程。,（三)基因载体 定义：为携带目的基因、实现无性繁殖或表达 成有意义的蛋白质而采用的DNA分子。作 用：携带目的基因进入受体细胞。特征：常用：质

5、粒DNA:pBR323 噬菌体DNA:pUC19 粘粒 病毒DNA YAC(酵母人工染色体载体),四、基本原理,过程:分、选（切）、接、转、筛、表。1分离目的基因。（目的基因的获取）2选择与构建基因载体。(切割目的基因和载体基因，便于连接。）3连接目的基因与载体。4重组DNA转入受体菌（细胞）。5筛选重组体。（含目的基因的受体菌或细胞）。6目的基因的表达。e.g:质粒为载体进行DNA克隆,（一）、目的基因的获取 途经 1.化学合成法。DNA合成仪 2.基因组DNA文库中筛选。限制性内切酶 3.cDNA文库中筛选。用于分离编码蛋白的基因 4.PCR dNTP 目的基因 酶、引物、模板,（二）、克

6、隆载体的选择和构建 a.常用载体：质粒、噬菌体、病毒DNA。b.目的基因离开染色体不能复制，需在载体(染色体）才能复制。c.根据操作基因的性质、目的 对载体和目的基因进行切割。,（三）、外源基因与载体的连接 原理：目的基因+载体 重组DNA分子 DNA连接酶 方式：粘性末端 自然 同一酶切点的连接（主）不同酶切点的连接 人工 同聚物加尾连接 人工接头连接 平头连接 相同或不同酶切后连接,（四）、重组体DNA导入受体菌方式：转化 转染 感染受体菌条件：安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷处于感受态 过程：无性繁殖。重组DNA导入受体菌，随受体菌生长、繁殖，重组DNA分子得以复制、扩增的 过程。,（五）

7、、重组体的筛选 筛选（选择）：将培养基中众多的转化 菌落（菌斑）分开，并鉴定 出带有目的基因的菌落的过程。方法：直接法 抗药性标志选择 标志补救 分子杂交法 非直接法 免疫化学法 酶联免疫检测法,（六）、克隆基因的表达 重组DNA技术目的：获得大量目的基因 基本目的 目的基因表达（蛋白质表达）医药应用 蛋白表达体系 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离、纯化 意义：合成有药用价值的蛋白或多肽 方式：原核表达体系 真核表达体系,五、临床,1.诊断 a.DNA诊断 b.DNA诊断的应用 产前诊断 携带者诊断 症状前诊断 预防 易感性诊断 器官移植组织配型 法医 2.治疗 a.DNA治疗（

8、基因治疗）e.g:间接体内体细胞基因治疗（ex vivo）b.生物制药,基本程序,1.选择治疗性基因（目的基因）2.选择基因载体3.选择靶细胞（受体细胞）4.基因转移（外源基因导入受体细胞）。间接方式 病毒载体5.筛选外源基因（利用标记物）6.回输体内（以不同方式回输获得 治疗性基因修饰后的细胞）,一、接合作用（conjugation)当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用。,二、转化作用（transformation)通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。,三、转导作用（tran

9、sduction)当病毒从被感染的细胞（供体）释放出来，再次感染另一细胞（受体）时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组。,图 15-3 转导作用,转导：通过病毒介导发生在供体细胞与受体细胞 之间的DNA转移及基因重组,插入序列转座插入序列（insertion sequences，IS）：长750 1500bp组成：反向重复序列：941bp，位于两侧转座酶编码基因：产物引起转座，位于中间正向重复序列：412bp，位于反向重复序列外侧，为插入序列所特有,转座：1.保守性转座从原位迁至新位2.复制性转座插入序列复制后，一个复制本迁到 新位，另一个保留在原位。,保守性复制,插入序列,+

10、,反向重复序列,+,靶位点,内切酶裂解,(转座酶),切端形成新的磷酸,二酯键(转座酶),新 DNA(poly I)合成,与连接(转座酶),位点特异的,重组(转座酶),老定位,新定位,图 15-4 插入序列的复制性转座,3,3,5,5,3,5,3,5,转座子转座转座子（transposons）：可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。反向重复序列组成 转座酶基因特殊基因：如抗生素抗性基因等,3,5,3,3,3,5,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,3,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,内切酶,

11、recBCD,DNA侵扰recA,分支迁移,recA,内切酶recBCD,DNA连接酶,Holliday中间体,机制,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,Holliday中间体,内切酶,ruvC,内切酶,ruvC,DNA连接酶,DNA连接酶,图15-6 同源重组机制,Holliday中间体,工具酶的定义,工具酶：指能用于DNA和RNA分子的切割，连接，聚合，反转录等有关的各种酶系统。,常 用 的 工 具 酶,工 具 酶 名 称 主 要 功 能限制性内切核酸酶 在DNA分子内部的特异性的restr

12、iction endonucleases 碱基序列内部进行切割DNA连接酶 将两条以上的线性DNA分子或片段DNA ligase 催化形成磷酸二酯键连接成一个整体DNA聚合酶I 通过向3端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链DNA polymerase I 裂口，即53DNA聚合酶活性与35及53外切酶活性多核苷酸激酶 催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的DNA polymerase kinease 5OH末端上反转录酶 以RNA或DNA链为模板合成互补的cDNA链reverse transcriptaseDNA末端转移酶 将多聚物尾巴加到了线性双链DNA terminal Deoxyn

13、uc 或单链DNA分子的3OH末端或DNA的3末端标dNTPleatidy transferase(接下表格),常 用 的 工 具 酶(续上表格)工 具 酶 名 称 主 要 功 能碱性磷酸酶 去除DNA,RNA,dNTP的5磷酸基团BAP orCIP核酸外切酶III 降解DNA3OH末端的核苷酸残基exonuclease III降解酶S1 降解单链DNA或RNA,产生带5磷酸的单核苷酸或nuclease S1 寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子的单链区核酸酶Bal 31 降解双链DNA,RNA的5及3末端，nuclease Bal31 高专一性单链核苷酸Taq DNA 聚合酶 能在高温（72

14、）下的单链DNA为模板，Taq DNA polymerase从53方向合成新生的互补链核糖核酸酶 专一性降解RNARNase脱氧核糖核酸酶 内切核酸酶，水解单链或双链DNADNase,限制性核酸内切酶的分类,按限制性核酸内切酶的分解模式，分为三类：类型I(有识别位点,切割长短不一而 无特异性)类型II(切后IIa含粘性末端&IIb为 平末端)类型III(界于I&II间),II型酶识别序列特点：1、识别特定序列，2、识别序列 48 bP。3、识别点 DNA回文结构。5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5,限制性内切酶的命名原则,命名原则：由分离出酶的微生物的属名第一个字母和种名的前两个字母组

15、成，如Eco(从Esherichia coli 大肠杆菌中分离出的酶);Hin(从Haemaphilu influenzae流感嗜血菌中分离出的酶)。微生物的株和型写在其后右下角EcoRI 若从某株中分离得数种酶为HindI.II,III,II型限制性内切酶的切割方式,三种切割方式：按切割位点相对于二重对称轴的位置来区分：一种是在对称轴5侧切割产生5粘端，5-NGAATTCN-3 EcoRI 5-NG AATTCN-3 3-NCTTAAGN-5 3-NCTTAA GN-5 5粘端 另一种是在对称轴的3侧切割产生3粘端，5-NCTGCAGN-3 PstI 5-NCTGCA CN-3 3-NGAC

16、GTCN-5 3-NG ACGTCN-5 3粘端 第三种切割方式是在对称轴处切割，就产生平末端 5-NCCC GGGN-3 SmaI 5-NCCC GGGN-3 3-NGGG CCCN-5 3-NGGG CCCN-5 平端,+,+,+,1.cDNA(complementary DNA):是指经反转录合成的，与RNA互补的单链DNA。以单链cDNA为模板，可合成双链cDNA。cDNA文库：将mRNA 反转录成cDNA，再复制成 双链cDNA，并与适当的载体重组后 导入宿主细胞，这种含有整个mRNA 信息的集合。,2.基因组DNA（genomic DNA）：指代表一个细胞 或生物体整套遗传信息（染

17、色体 及线粒体）的所有DNA序列。基因组文库：将某种细胞的基因组DNA切成一 定大小的片段，并与适当的载体重 组后导入宿主细胞，这种含有整个 基因组DNA信息的集合。,载体特征：1.能自主复制；拷贝数高2.有筛选标记，（如对抗菌素的抗性，某些基因产物 的显色反应等。）便于重组体的筛选和鉴定。3.有克隆位点（外源DNA插入点），具有多个单一酶切位点，称多克隆位点4.分子量小，能容纳较大的外源DNA。,1.质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对。常有1 3个抗药性基因，以利于筛选。,质粒,图 15-7 质粒 pUC19,396,质粒获得目的基因,2.

18、噬菌体（phage）DNA 噬菌体DNA改造系统 gt 系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）M13噬菌体DNA改造系统（含lac Z基因）M13mp系列 pUC系列,二、重组DNA技术基本原理,粘性末端连接,抗药性标记选择（插入失活法）：将目的基因插入带ampr和tetr基因载体的tetr基因中，则tetr基因失活。在分别含有氨苄青霉素和含四环素的两个培养基中培养，进行筛选。,标志补救：若目的基因能够在宿主菌表达，且表达 产物与宿主菌的营养缺陷互补。就可利用对营养素的依赖表型来筛选,分子杂交法：利用32P标记的探针与转移至硝酸纤维素 膜上的转化子DNA或克隆的

19、DNA片段进行分 子杂交，直接选择并鉴定目的基因。原位杂交 Southern印迹,硝酸纤维膜菌落琼脂培养板,硝酸纤维膜,复制培养,溶菌、中和蛋白酶处理漂洗、烘干,1、32P探针 2、放射自显影,鉴定克隆（含感兴趣DNA）,图15-10原位杂交,1.原核表达体系E.coli的标准：选择标志强启动子翻译调控序列多接头克隆位点E.coli的不足：缺乏转录后加工机制缺乏翻译后加工机制表达产物形成不溶性包涵体很难表达大量可溶性蛋白,2.真核表达体系如酵母、昆虫及哺乳类动物细胞优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区积累缺点：操作技术难、费时、不经济转染：将表达载体导入真核细胞的过程,总结：,基因重组 定义 意义 类型 方式（接合、转化、转导、转座）基因工程 定义 意义 基本要素 原理 临床,