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1、第十五章 核酸的研究方法,1、核酸的分离、提纯和定量测定,DNA的分离RNA的分离核酸的定量,Isolation of Nucleic Acids,Goals:removal of proteinsDNA vs RNAisolation of a specific type of nucleic acid,Types of Methods:differential solubilityadsorption methodsdensity gradient centrifugation,Types of DNA:genomic(chromosomal)organellar(satellite)pl
2、asmid(extra-chromosomal)phage/viral(ds or ss)complementary(mRNA),General Features:denaturing cell lysis(SDS,alkali,boiling,chaotropic)enzyme treatmentsproteaseRNase(DNase-free)DNase(RNase-free),Collection of cells,Use soft brushes to dislodge epithelial cells lining the mouth.,Ample cell collection
3、is very critical for success.,Whats in Lysis Buffer?Tris buffer to maintain pH of solution so that DNA is stableSDS to dissolve membranes of cell,allowing DNA to be released into solutionSDS also denatures proteins,making them more susceptible to protease cleavage,Lysis buffer,Why add Protease?,Prot
4、ease destroys nuclear proteins that bind DNA,and cytoplasmic enzymes that breakdown and destroy DNA(nucleases)Protease treatment increases the yield of DNA,Adding salt(5M NaCl),Na+binds to phosphate groups of DNA,neutralizing the electric charge of DNANaCl allows DNA molecules aggregate instead of r
5、epelling each other,making it easier for DNA to precipitate out of solution when alcohol is added,Adding ice cold alcohol,DNA cannot dissolve in alcoholThe addition of cold alcohol makes the DNA clump together and precipitate out of solutionPrecipitated DNA molecules appear as long pieces of fluffy,
6、stringy,web-like strands,Microscopic oxygen bubbles“aggregate”or“fuse”together,simultaneously with the DNA precipitationThe larger,visible air bubbles act to“lift”the DNA out of solution,from the aqueous into the organic phase,DNA Precipitation,High MW Genomic DNA Isolation,Typical ProcedureCell Lys
7、is0.5%SDS+proteinase K(55o several hours)Phenol Extractiongentle rocking several hoursEthanol PrecipitationRNAse followed by proteinase KRepeat phenol extrac-tion and EtOH ppt,Phenol Extractionmix sample with equal volume of sat.phenol solnretain aqueous phaseoptional chloroform/isoamyl alcohol extr
8、action(s),High MW Genomic DNA Isolation,Typical ProcedureCell Lysis0.5%SDS+proteinase K(55o several hours)Phenol Extractiongentle rocking several hoursEthanol PrecipitationRNAse followed by proteinase KRepeat Phenol Extrac-tion and EtOH ppt,EtOH Precipitation2-2.5 volumes EtOH,-20ohigh salt,pH 5-5.5
9、centrifuge or spool out,Isolation of RNASpecial Considerations,RNAse inhibitors!extraction in guanidine saltsphenol extractions at pH 5-6(pH 8 for DNA)treatment with RNase-free DNaseselective precipitation of high MW forms(rRNA,mRNA)with LiCloligo-dT column,2、核酸的沉降特性,通常很难分离出完整DNA分子，但可得到分子量不太大的环状DNA，
10、这类制剂包括：共价闭环DNA：常呈超螺旋型开环DNA：双链环状DNA的一条链断裂，分子呈松弛态线型DNA：环状DNA的双链断开,在超速离心机造成的离心力场中，溶液中的核酸下沉的速率会大大加快，这是核酸的沉降特性，该技术可研究：核酸在溶液中的构象 测定核酸的沉降系数和相对分子量,氯化铯密度梯度沉降平衡超离心法,核酸密度测定测定DNA中G-C之含量溶液中核酸构象的研究用于核酸的制备,Density Gradient Centrifugation,rate zonal/sucrose(size fractionation)electrophoresis more commonisopycnic/Cs
11、Cl(density)DNA 1.7 g/cm3protein 1.3 g/cm3RNA DNAssDNA dsDNAGC content,CsCl Gradients,Applicationslarge scale preparationshigh puritysatellite DNARNA cushions,CsCl Gradients,三、核酸的凝胶电泳,凝胶电泳兼有分子筛和电泳的双重效果,不纯核酸样品：琼脂糖凝胶电泳分离出区带溴化乙锭染色紫外灯下粗略估计含量,电泳迁移率取决于：,核酸分子大小胶浓度DNA的构象电流碱基组成温度,凝胶电泳的样品可进行回收,聚丙烯酰胺作为支持物孔径小于丙烯
12、酰胺可分析小于1000bp的DNA片断,聚丙烯酰胺凝胶电泳,4、核酸的核苷酸序列测定,DNA一级结构的测定,Sanger发明的末端终止法M.Maxam和W.Gilbert 发明的化学断裂法焦磷酸测序。前两种方法一般都会用放射性32P对DNA进行标记，需要使用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对长度不同的核酸片段进行分离，分离以后还需要使用放射自显影的技术进行观察和分析。目前已普遍使用荧光物质代替放射性同位素对DNA进行标记。焦磷酸测序是新一代DNA序列分析技术，该项技术无需电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。,末端终止法,末端终止法也叫双脱氧法。要想理解此方法的原理，需要对DNA复制的过程有所
13、了解。DNA是一种双螺旋分子，其复制是在DNA聚合酶催化下，以原来的两条母链上的核苷酸序列为模板，通过互补配对的方式合成新DNA链的过程。复制需要引物和四种dNTPs，总是从5-端向3-端进行。细胞内DNA复制的引物一般是RNA，但体外DNA复制的引物可以是人工合成的与模板链互补的一段寡聚脱氧核苷酸。复制开始于引物3-端自由的羟基，依据碱基互补配对的原则，不断地形成新的3,5-磷酸二酯键，使DNA链得到延伸，直到一个新的DNA分子完全被合成。,末端终止法,进行四组平行反应每一组反应混合物含有dATP,dGTP,dCTP和dTTP，有一种被32P标记每一组反应含有一种少量的ddATP或ddGTP
14、或ddCTP或ddTTP。在多数情况下，聚合酶使用正常的核苷酸，DNA合成正常延伸。有时，聚合酶使用ddNTP，而导致末端终止。每一组反应中ddNTP的随机插入留下一系列长度不等的以该双脱氧核苷酸结尾的DNA链。对每一组反应混合物走凝胶电泳。片段越短，走的越快，就越靠近凝胶的底部。从凝胶的底部向上读出序列。将读出的序列转化成互补链的序列。,化学断裂法,其基本原理是用特殊的化学试剂，处理待测的具有末端放射性同位素（32P）标记的单链DNA或者只有一条链的末端被放射性同位素标记的双链DNA片段，造成特定碱基的修饰、脱落和戊糖-磷酸骨架被特异性切割，从而产生一组长度不同的DNA链降解产物，经聚丙烯凝
15、胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。,化学断裂法,进行四组平行的反应：G特异性剪切 在碱性条件下，先用硫酸二甲酯（DMS）处理，然后再使用哌啶处理。嘌呤碱基特异性剪切DNA先进行酸处理，然后再加DMS。嘧啶碱基特异性剪切先用肼处理，然后用哌啶处理。C特异性剪切在高盐浓度下，先用肼处理，然后用哌啶处理。即进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影。比较G、AG、CT和C各个泳道，自下而上从自显影片上就可读出DNA序列。,焦磷酸测序,焦磷酸测序需要在同一反应体系中发生由4种特异性酶催化的级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就
16、可以将其掺入到引物链的3-端并释放出等量的焦磷酸基团（PPi）。PPi可转化为可见光信号，并最终转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。第一轮反应结束后，再加入下一种dNTP，继续下一轮DNA链的合成。,DNA自动分析仪的组成,RNA一级结构的测定,目前用来测定RNA一级结构的方法主要有：（1）先使用逆转录酶将待测RNA逆转录成cDNA，然后再使用Sanger的末端终止法进行测定；（2）用化学或/和酶学方法对放射性同位素标记的RNA进行部分消化后，再进行聚丙烯酰胺电泳分析；（3）质谱法,DNA Sequencing Analysis,Sanger dideoxynucle
17、otide chain termination analysis,Procedure for the Sanger dideoxy chain termination technique DNA to be sequenced is cloned into a vector,adjacent to a primer site Four reactions are set up-each containing one of four ddNTPs DNA is synthesized in the presence of the ddNTPs,giving rise to sets of DNA
18、 products representing all of the possible size fragments for the unknown sequence The fragments are resolved by gel electrophoresis and the sequenceis read up from the bottom of the gel by identifying the lane givingthe next larger size fragment,DNA to be sequenced is cloned into the EcoRI site imm
19、ediately adjacent to the primer binding site,53,|,3,For sequencing the DNA is denatured into single strands the primer is hybridized to the template strand DNA is synthesized using DNA polymerase,structure of a dNTP structure of a ddNTP(dideoxynucleotide),O,BASE(A,T,G,C),HO,O,P,O,P,O,P,C,O-,O-,OH,O,
20、BASE(A,T,G,C),O,P,O,P,O,P,C,O-,O-,OH,53,|,ddATPDNAdNTPs,ddTTPDNAdNTPs,ddGTPDNAdNTPs,ddCTPDNAdNTPs,A T C A T G T C A T C A A G T C T A G C A C,T A,T A G T A,T A G T A C A,T A G T A C A G T A,T A G T A C A G T A G T T C A,T A G T A C A G T A G T T C A G A,All possible products of the reactioncontainin
21、g ddATP,Each fragment is terminated by a ddA,53,|,A T C A T G T C A T C A A G T C T A G C A C,A,T,G,C,TAGTACAGTAGTTCAGATCGTG,Longer fragments,Shorter fragments,Sequenceof thestrandthat wassynthesized,5、聚合酶链式反应,PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复
22、制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。,PCR技术的基本原理,PCR反应成分：1.模板DNA；2.引物；3.四种脱氧核糖核苷酸；4.DNA聚合酶；5.反应缓冲液、Mg2+等。PCR反应基本步骤：1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（94，30s）。2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55，30s）。3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（7072，3060s）,5GGATCTAGCGTATGCTTGAAA33C
23、CTAGATCGCATACGAACTTT5,模板DNA,3 GAACTTT 5,引物1,5GGATCTA 3,引物2,图1 PCR引物与模板结合示意图,1.变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程。2.退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子。3.延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按53方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式
24、增加。,模板DNA,55退火,70延伸,2530 次循环,目的片段扩增2n倍,94变性,PCR原理示意图,PCR反应产物积累规律示意图,平台期,产物量,时间,6、DNA的化学合成,寡核苷酸的化学合成起步于20世纪四十年代末 1955年，剑桥大学的Todd实验室成功合成了具有磷酸二酯键结构的TpT,并获得1957年诺贝尔奖 1965年，Khorana等利用化学方法大量合成脱氧核苷的单一聚合物或二种、三种脱氧核苷的重复序列，人工合成的六十四种核糖三糖苷，研究蛋白质的生物合成过程，从而确定了氨基酸的三联密码子，因此而获得1968年诺贝尔奖 六十至七十年代，寡核苷酸的化学合成方法不断完善，逐渐形成了今
25、天被广泛应用的固相亚磷酸三酯法并实现了合成的自动化,固相合成寡核苷酸,Routine processMicroprocessor-controlled instrumentSynthesis on a solid supportFirst base(3)attached to solid supportSynthesis direction is 35,DNA的合成有磷酸三酯法、亚磷酰胺法、氢磷酸法等，现在常用的是固相亚磷酰胺法,合成时所用单体不是脱氧核苷三磷酸，而是核苷酸的亚磷酰胺衍生物,二甲氧基三苯甲基（DMT）,经过化学修饰的核苷酸,3位P上二异丙胺基，缩合所用的功能基3位P上腈乙基，保
26、护基，合成完毕后脱去。5-DMT，保护基，缩合前脱去。A和C的杂环氨基上的苯甲酸保护基，合成完毕后脱去。G上嘌呤环氨基上的异丙酰保护基，合成完毕后脱去。,固相支持物,最常用的固相载体为可控微孔玻璃珠（CPG，controlled pore glass），CPG的孔径根据所合成的寡核苷酸的长度而定，一般合成链长小于60nt时，选择孔径500埃，链长大于60nt时，使用1000埃CPG，使用CPG的缩合效率高达98%-99.9%，可以满足合成长达175nt的寡核苷酸的条件。CPG通过连接化合物与初始核苷酸的羟基共价结合，核苷酸的5羟基用二甲氧基三苯甲基（DMT）保护。,合成过程中的第一个寡核苷酸,
27、合成的具体步骤,去封闭,用三氯乙酸去除CPG所连核苷上的DMT,以暴露5羟基，供下一步缩合。活化,在缩合之前，单体与四唑混合并进入合成柱，此时四唑提供一个质子给3磷酸上二异丙胺基的N原子，质子化的二异丙胺是一个良好的游离基团，与四唑形成亚磷酰胺四唑这种活性中间体。连接，亚磷酰胺四唑与CPG所连的核苷酸碰撞时，与其5羟基发生亲核反应，发生缩合并脱掉四唑，合成的寡核苷酸链延长一个。盖帽,为了防止未反应的与CPG相连的5羟基在随后的循环中被延长，需要在连接反应充分进行之后使之封闭，常用乙酰化来封闭此羟基。临用前混合乙酸酐和N-甲基咪唑等形成一活性很强的乙酰化试剂，与少量为参与连接反应的5羟基缩合成酯
28、键。氧化，连接反应后新加上的核苷酸通过亚磷酯键（磷为三价）与CPG上相连的寡核苷酸链连接，此亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，因此需将此处三价磷氧化为五价的磷。常用的氧化剂为碘的四氢呋喃溶液。,Detritylation,Activation and Coupling,Capping,Oxidation,合成后处理,切割：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPG上连接化合物与初始核苷间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的3羟基。脱保护基：须在此步前选好后续的纯化方法。一般用新鲜的浓氨水处理较长时间以脱掉腈乙基、苯甲酰基、异丙基，用三氟乙酸脱5-DMT.纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有：C18柱、OPC柱、PAGE和HPLC。定量。根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。,
