《基因工程的主要技术原理.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程的主要技术原理.ppt（44页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、第二章 基因工程的主要技术原理,一、质粒DNA的提取,闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；,（1）原理,1.碱裂解法提取质粒DNA,DNA双链,变性,DNA单链,复性,强碱,中性,染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起;当K+取代Na+时,生成不溶的PDS,这些复合物从溶液中沉淀下来。,变性,利用宿主菌线状染色体DNA与闭环双链质粒DNA的结构状态的差异来提取质粒DNA。当同时碱变性时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。当条件恢复时（酸中和），质粒DNA迅速准确配置重新形
2、成完全天然超螺旋分子，而线状DNA则与破裂的细胞壁，细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖。当K+取代Na+时,这些复合物会从溶液中沉淀下来，附在细胞碎片上一起被离心除去。,碱裂解法,（2）所用的试剂作用,葡萄糖,增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。,EDTA,Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。,NaOH-SDS,NaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS:溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。,冰醋酸把醋酸钾溶液的pH调到4.8。用来中和NaO
3、H变性液，使DNA复性。,高浓度的K+置换Na+,生成不溶的PDS,用于沉淀DNA。,乙醇,DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。,KAc-HAc缓冲液,RNase A,降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。,TE缓冲液,DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。,Tris-HCl维持溶液中pH值相对稳定；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。,蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。（现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。,酚-氯仿,选用,以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。,（3）碱抽提法
4、提取质粒DNA的步骤,Solution I 的配制：,使用“溶液”悬浮菌体。,第一步：悬浮菌体,25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA，,溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。,第二步：破膜，蛋白质和DNA变性,Solution II 的配制：,第三步：中和,溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA沉淀。,Solution III的配制：,0.2N NaOH，1.0%SDS,5M 乙酸钾（用冰醋酸调pH至4.8）,上清液中含有闭合质粒DNA。,第四步：离心除去沉淀,0.6倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇。,第五步：纯化DNA,上清液过柱或酚-氯仿
5、抽提。,第六步：沉淀DNA,与待扩增的模板DNA区段的两3端序列互补（5端相同）的短DNA。,位置,3,3,引物设计现在多用专业软件,如Primer5.0等,二、引物（primer)设计,引物的长度,一般引物设计为长1830bp。,引物的特异性,引物应与核苷酸序列数据库的其他序列无明显同源性。,引物的碱基序列,5端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。,5ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3,3GCTAGCTACTTAAG5,3端（特别是最末及倒数三个碱基）必须与模板严格配对，5端可以不配对。,template,p
6、rimer,尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力,G+C含量以 45%-65%为宜。,引物的碱基组成,避免连续4个以上相同碱基排列或内部回文序列.,5GGCAGTCTGCCAGTCTAC3,CTGCCAGTCTAC3,GACGG5,T,发卡结构,1）,2）,3）避免形成引物二聚体（dimer）,两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。,5GGTCTGCCAGTCTAC3,3CAGGACTTAGTCACT5,primer1,primer2,引物的Tm值,Tm=（G+C)4+(A+T)2,适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。,实际复性温度选择低于T
7、m值5-10 oC。,经验公式计算：,Tm值是指溶液中有半数的DNA分子解链为单链时的温度。两条引物的Tm值尽可能相等或相近，最好相差不超过2 oC。,三、增加PCR特异性的措施,（1）引物设计（2）引物的退火温度（3）循环次数（4）Taq DNA聚合酶，利用高保真DNA聚合酶（5）降落PCR（6）热启动PCR（7）巢式PCR,四.PCR技术的扩展,（1）巢式PCR(nest PCR),此时进行二步PCR，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步不饱和PCR扩增，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二
8、级引物扩增。除了提高PCR的产量外，还提高了最终产物的特异性。,为了增加产物的特异性，设计2组引物（套嵌引物），结合位点依次位于前一组引物之间，进行2轮扩增。第一轮的PCR产物稀释100-200倍作为下一轮的扩增模板，进行不饱和扩增（10-15 cycles）。,1,3,2,4,（2）热启动PCR(hot start PCR),（3）降落PCR,配制的体系不变,PCR扩增的程序设置上变化:,无带,先降,再稳定扩增有带,先高温稳定扩增,再降,退火温度60,（4）长片段PCR(long-range PCR),引物设计 25-30bp Tm相差不超过1 扩增参数 缩短热变性时间，94 2 min 尽
9、可能使升温、降温过程缩短 适当增加延伸时间，可到20min 二步法扩增,94 2 min(预变性)94 30 sec,65 17 min 72 7 min 35个循环,（4）长片段PCR(long-range PCR),反应体系 选用扩增长片段的Taq酶 选用扩增高GC含量的 PCR buffer 结合热启动和降落PCR进行,低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后只有高浓度的引物，继续合成单链DNA。最后产物中99%是单链DNA。,（5）不对称PCR,3,5,5,3,引物少,用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。,引物浓度：,两个引物的浓度相差100倍。,（5）不对称PCR,退火温度不对
10、称,一条引物长，另一条引物短,PCR时，先是低温退火，一定循环后，提高退火温度，使短的引物不能结合模板，达到产生单链。,（6）反向PCR,扩增两个引物外侧的未知序列,把线性DNA模板转变成环形分子。,template,template,3,5,5,3,（传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列）。,技术关键：,使引物的外侧序列“转变”成内侧序列。,（7）TAIL-PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR),template,template,5,3,3,5,P1,P2,P3,AD,P1,P2,P3为特异性引物，25bp,Tm 65 左右AD为简并引物，15-1
11、6bp,Tm 44-45,已知序列,Liu,YG and Whittier RF(1995).Genomics 25:674-681.,1、Southern blot,双链DNA,检测,放射自显影,转膜,洗膜,杂交,标记的探针,NaOH或高温变性,原理和方法:,五.分子杂交 技术,应用:基因拷贝数检测;基因文库筛选,获取目的基因;遗传疾病诊断;转基因样品检测,等,2、Northern blot,是相对于Southern blot而命名的。利用DNA-RNA链或RNA-RNA链杂交的原理，通过DNA（或RNA）探针检测RNA样品。,原理和方法:,单链RNA,变性胶电泳分离,检测,放射自显影,转膜
12、,洗膜,杂交,标记的探针,NaOH或高温变性,应用:主要用于基因在转录水平上的表达研究。基因时空特异性表达，及表达模式分析；候选基因表达分析，有利于排除候选 基因，等,Northern blot的原理与Southern blot相比 有三点不同:(1)检测的对象不同.(2)变性方法是不同的,它不能用碱变性,因为 碱变性会导致RNA的降解.(3)探针不同.,3、Western blot,通过抗体与靶蛋白的抗原特异性反应检测蛋白质样品。主要用于基因在蛋白质水平上的表达研究。,Western blot的原理与Southern blot相比 有两点不同:(1)检测的对象不同.(2)探针的性质不同,在Western blot中使 用的探针是抗体(蛋白质),
