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1、细胞增殖与凋亡的原位检测技术,一、细胞增殖活性原位检测技术,细胞增殖(cell proliferation)是细胞数量的增加，其快慢即为增殖活性。,G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到DNA复制之前的间隙时间；G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期，G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。,细胞周期图,G0期细胞：细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期,依据细胞的分裂能力，机体的细胞分为三类：不稳定细胞(labile
2、cells)，持续分裂细胞稳定细胞(stable cells)，静止细胞 处G0期永久细胞(permanent cells)，不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞,根据细胞周期将细胞群分为两类 分裂细胞指进入G1期后进行分裂的细胞；非分裂细胞是指处于G0期细胞及非增生的终末细胞。,肿瘤细胞群也如此。,增殖分数或生长分数 分裂细胞与细胞总数之比值。生长分数值越大，增殖活性越高。测定生长分数能判断细胞群的增殖活性，即增殖快慢。,生理状态下：不稳定细胞、稳定细胞呈现着活跃或较活跃的增生，补充因凋亡而丧失的细胞，保持机体、器官或组织细胞数量的动态平衡。,病理状态下：反应性增生 组织细胞损
3、伤或炎症刺激等均可引起细胞增生；肿瘤性增生 肿瘤的本质是细胞增生紊乱。即使去除刺激因素，瘤细胞仍可持续增生。,原位研究细胞增生活性，不仅涉及生理性及反应性细胞增生，更多是研究肿瘤细胞的增生活性。,（一）原位检测细胞增生活性的常用方法 及注意事项 测定细胞增生活性的方法有：核分裂像计数 Feulgen染色后显微分光光度法 免疫组织（或细胞）化学技术显示与细胞增生与分裂相关的抗原,嗜银核仁组织区法(argyrophil-stained ucleolar organizer region AgNORs)3H标记胸腺嘧啶脱氧核苷掺入标记技术溴脱氧尿嘧啶核苷（胸腺嘧啶脱氧核苷相似物）标记技术流式细胞术测
4、定S期细胞分数,1.核分裂像计数,核分裂像是人们可直接识别的细胞周期不同阶段的唯一细胞形态。因此，用光学显微镜就能进行计数。,核分裂像计数有两种方法 高倍视野法（HPF）一般在400倍放大下，随机选择一定数量（10个或更多）的HPF，分别观察并计数其中的核分裂像，最后算出平均每个HPF中的核分裂像数。,核分裂指数（MI）测量时，可在显微镜目镜内放置网格测微尺，随机选择一定数量的视野，计数不同区域一定数量的网格内核分裂像数，最后算出占所测细胞总数之比例，实质上是一种生长分数。,注意事项：严格控制切片厚度 在较厚的切片观察时，微调显微镜可在不同平面计数核分裂像，与较薄切片相比，显然增加了计数机会。
5、组织标本固定时间 若组织不及时固定，细胞仍有分裂机会，也会增加核分裂计数可能性。切片不能过染 切片过染会导致核分裂像辨认困难。用同一台或HPF面积相同的显微镜计数,2.免疫组织（或细胞）化学方法 通过染色细胞增生相关的核蛋白判断细胞的增生活性。Ki67 因其所测的蛋白只表达在G1，G2，M和S期的细胞，G0 期及G1早期细胞不表达。,PCNA 是针对增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的抗体。在除G0期外的其它时相细胞均可测出。但水平不一，G1期迅速增加，G1/S交界期达高峰，S期维持高水平，G2期开始下降，G1早期和M期表达水平最低
6、。,MCM蛋白（微染色体维持蛋白）是启动DNA复制和延伸的关键蛋白。只在具有增殖潜能和增殖细胞中表达。可显示整个细胞周期细胞。,DNA拓扑异构酶a 是一种核酶，参与DNA复制、基因转录、染色体聚集及催化有丝分裂和减数分裂的染色体分离，在细胞增殖中其重要作用。,细胞周期中不同时期的关卡蛋白或调节元件 细胞周期素A、B、C、D、E 周期素依赖性激酶（CDK）,Ki67或PCNA抗原在核内表达故增生细胞的核呈棕色或红色，用苏木素衬染也能清楚区分阳性与阴性细胞。,Ki67,Ki67,肠腺瘤,肠腺癌,Ki67,Ki67,PCNA,PCNA,PCNA,Ki67LI，PCNA LI 采用计数核分裂像的方法，
7、计数并算出标记细胞与所测细胞总数之比，称为标记指数（1abelling index，LI），也是一种生长分数。,肠腺瘤,肠腺癌,3.DNA含量测定 正常体细胞含二倍体基因组DNA。S期的DNA合成使细胞遗传信息增加。并可出现二倍体以上甚至四倍体DNA。因此，能测量DNA含量的方法，如胸腺嘧啶标记、溴脱氧尿核甙掺入、流式细胞术及Feulgen染色后均可测定细胞的DNA含量。Feulgen染色后显微分光光度计或计算机图像分析能在原位检测DNA含量。,Feulgen染色,测定时以组织中的静息淋巴细胞DNA含量为二倍体对照，与所测细胞比较，就可测出DNA含量不同的增生细胞的比例。,4.嗜银核仁组织区法
8、 NORs含有核糖体基因和一些对银有高亲和性的酸性蛋白质。简单的一步银染法即可显示NORs。光镜下，NORs为的黑色小点多数直径约0.51um，位于核内，也可见于分裂细胞的染色体上。,AgNOR,AgNORs计数方法 人工光镜观察组织切片时应计数至少100个细胞，而观察涂片为50个细胞。如用全自动图像分析仪计算机计数，可计数数百或更多细胞。最后将结果表示为单位细胞核的AgNORs颗粒数。除AgNORs颗粒数外，其形态分类及分布部位在良恶性肿瘤的鉴别中也有应用价值。应特别注意计数区域的选择应有良好的随机性。,测定细胞增生活性方法间的关系及其选用 原位测定细胞增生活性要求方法简单、经济、重复性好、
9、能常规使用，结果容易判断。以此为标准，核分裂像计数、免疫组织（细胞）化学及AgNORs都有各自的优点。,feulgen染色与流式细胞术相比，不需要将组织制成细胞悬液，所测得的增生活性更能反映组织原位的本来面貌。原位测定细胞增生活性所测的结果都可定量表示，大大避免了主观因素的影响，成为定量病理学的重要组成部分。,各种方法相关性的比较研究表明核分裂像计数、Ki67 LI、PCNA LI及AgNORs计数等之间均有明显的相关性。,如果您的实验室暂时尚不具备现代实验条件只要有显微镜，只要您能准确识别核分裂像，只要能避免那些影响重复性的因素，在创新思想的设计下，即便使用最简单的方法，也可取得有意义的结果
10、。,（二）测定细胞增生活性的应用与价值,判断肿瘤的良恶性,肿瘤的病理学分级,判断肿瘤患者预后,测定细胞增生活性除广泛应用在肿瘤学领域外，在非肿瘤性疾病如肾小球肾炎，类风湿性疾病，宫内膜异位症也有应用，在凡涉及反应性增生的疾病中，也有广泛应用的前景。,细胞凋亡（apoptosis），或称程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）或细胞自杀（cell suicide），是细胞自身的一种主动的、生理性死亡机制，是一个多步骤发生的、受基因调控的遗传机制。,二、细胞凋亡检测技术,细胞坏死与细胞凋亡示意图,1.正常细胞,2.凋亡细胞皱缩,3.凋亡细胞分叶 凋亡小体形成,4.巨噬细
11、胞吞噬凋亡小体,5.细胞肿胀,6.细胞崩解、自溶,（一）凋亡过程中细胞的形态学变化,（二）细胞凋亡的形态学检测方法 大部分情况下发生的凋亡都具有典型的形态学特征，因此可通过各种方法制片及染色后，用光镜、荧光显微镜，或电子显微镜进行观察，其识别比较容易。,1.凋亡细胞的光镜和荧光显微镜检测（1）制片 常规组织学切片，进行脱蜡和水化。培养细胞可用细胞离心仪制片。由于凋亡细胞在制片中容易破碎，所以应采用低速离心制片（250g，离心5min），并事先将载玻片做防脱片处理，使细胞易于贴附。离心后的片子稍经空气干燥后，迅速于1多聚甲醛4oC下固定1530min，然后转入80乙醇后固定12h，保存于-20o
12、C待用。,（2）染色方法 可采用常规的组织学染色方法，如苏木素-伊红染色，特殊染色如甲基绿-派诺宁染色、Giemsa染色。,采用荧光染料Hoechst33342和Hoechst33358DAPI（4，6diamidino-2-henylindole）PI（propidium iodide）,荧光染料Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜，使其染上低蓝色。凋亡细胞的蓝色荧光增强。凋亡细胞的膜通透性增强，进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞多，荧光强度比正常细胞高；凋亡细胞的染色体DNA的结构发生改变从而使该染料能更有效地与DNA结合；凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤
13、，不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外而在细胞内积累。,（）结果观察 细胞体积缩小及变形；核浓染及丧失亚形态结构，可见核染色质呈新月形，或核碎裂成大小不等核碎片；在组织学切片中可见巨噬细胞或邻近的上皮细胞吞噬凋亡细胞或凋亡小体。,凋亡小体,Hoechst 33342染色,期细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；b期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。,2.凋亡细胞的电镜观察 采用电镜常规方法固定、包埋和制片。可用透射电镜或扫描电镜进行观察。透射电镜下，凋亡细胞核染色质浓缩、核膜消失，内质网扩张，而其
14、余细胞器如线粒体等形态结构仍保持良好。扫描电镜下，细胞表面结构如伪足、微绒毛等消失，细胞膜呈现波浪状起伏。,3.凋亡细胞的原位末端转移酶标记（TUNEL）细胞凋亡的多步骤机制作用的最终环节，是细胞内源性核酸内切酶的激活而导致核染色质DNA双链的断裂。大量DNA断片暴露出的3羟基在末端转移酶(TDT)或DNA多聚酶的作用下，与生物素或地高辛标记的核苷酸结合，最终借助卵白素或抗地高辛抗体结合的荧光素或辣根过氧化物酶，使凋亡细胞被特异性地标记和显示出来。,凋亡细胞DNA断片暴露出3羟基,末端转移酶(TDT),DNA多聚酶,核苷酸,生物素,地高辛,卵白素,抗地高辛抗体,辣根过氧化物酶荧光素,（1）标本
15、收集 经福尔马林固定的常规组织学切片。冰冻切片，4多聚甲醛4下固定30min，80乙醇后固定2h以上（或于80乙醇内保存于-20oC冰箱待用）。各种临床细胞学涂片、刮片、脱落细胞学制片或从组织块制作的细胞悬液制片以及培养细胞的制片等等，用1-4%多聚甲醛，4下固定15-30min，然后于80%乙醇内后固定2h以上。,（2）标本处理 组织学切片在脱蜡和水化后，先用20ug/ml蛋白酶K作用1020min后，再进行其他步骤。其余细胞学制片均需水化后，用PBS洗涤三次，每次10min然后进行标记。（3）标记步骤 按试剂盒说明进行,荧光显微镜下，凋亡细胞被特异地标记上很强的绿色荧光，同时显示出其它的凋
16、亡形态学特征；而未凋亡细胞无绿色荧光，仅显示出PI的红色荧光，且其细胞核形态完好。,（4）结果观察,HL60细胞,Apoptotic cells(arrowheads)in the mammary gland as detected with the TUNEL assay(red cells express keratin 5;hematoxylin counterstaining).,4.凋亡细胞的免疫组化检测法,活性Caspase免疫组化检测 Caspase是一些半胱氨酸蛋白酶，在凋亡程序的启动和执行过程中起非常重要的作用，直接参与凋亡的早期启动、凋亡信号传递及凋亡晚期事件，导致细胞皱缩、膜出泡及DNA断裂。,细胞外膜磷脂酰丝氨酸的亲和细胞化学检测,凋亡早期磷脂酰丝氨酸从细胞膜内侧转移到外侧，作为免疫检测识别标记，通过生物素偶联的Annexin V（钙离子依赖性磷脂结合蛋白），经相应的酶联显色系统进行进行亲和细胞化学染色，可以检测早期凋亡细胞。,
