微生物初级代谢产物的代谢调控.ppt

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1、微生物细胞有着一整套可塑性极强和极精确的代谢调节系统，以确保上千种酶能准确无误、有条不紊和高度协调地进行极其复杂的新陈代谢反应。在发酵工业中，调节微生物生命活动的方法很多，包括生理水平、代谢途径水平和基因调控水平上的各种调节。,3.微生物初级代谢产物的代谢调控,微生物细胞内的代谢调节主要通过酶合成量、酶活性及细胞膜透性的控制加以实现。,原则：经济合理地利用和合成所需的各种物质和能量，使细胞处于平衡生长状态。方式：反馈抑制、反馈阻遏、酶的诱导调节、酶的共 价修饰。目的：高浓度地积累人们所期望的产物。平衡 打破 建新平衡高浓度地积累办法：育种，得到根本改变代谢的基因突变株；控制微生物培养条件，影响

2、其代谢过程。,3.1 酶的合成调节,酶的合成调节是通过控制酶的合成量来调节代谢 速率的方式。包括诱导调节和阻遏调节两种方式。通过酶合成量调节代谢速率是一种间接而缓慢的方 式，属于粗放的调节，称之为“粗调”。,优点：通过阻止酶的过量合成降低代谢速率，节约用于生物合成的原料和能量。,两个概念:组成酶：细胞内总是适量存在的，不依赖于酶底 物或底物结构类似物的存在而合成的酶。诱导酶：依赖于酶底物或底物结构类似物的存在 而合成的酶。其基因以隐性状态存在于染色体中。,诱导调节（induction）,诱导酶的合成需要诱导剂，它可是底物，也可是底物的结构类似物。一种酶可有多种诱导剂，其能力与诱导剂的种类和浓度

3、有关。如E.coli在含乳糖培养基上产生的-半乳糖苷酶、-半乳糖苷透性酶和半乳糖苷乙酰基转移酶就是由于乳糖的存在而诱导产生的。大肠杆菌在加入乳糖前-半乳糖苷酶的分子数为5个；加入后的1-2分钟内就增加到5000个。（诱导作用，非激活作用）,诱导作用的类型：协同诱导和顺序诱导,指一种底物能同时诱导几种酶的合成。如将乳糖加入到E.coli培养基中，细胞同时合成-半乳糖苷透过酶、-半乳糖苷酶和半乳糖苷转乙酰酶。,指先合成分解底物的酶，再依次合成分解各中间产物的酶，达到对复杂代谢途径的分段调节。,协同诱导,顺序诱导,阻遏调节（repression）,某种代谢物积累除抑制酶活性外，还可反馈阻遏酶合成，降

4、低反应速度。在微生物的代谢过程中，当某途径的末端产物过量时，可通过阻碍该代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的生物合成，彻底控制代谢和末端产物合成。,方式：末端代谢产物阻遏和分解代谢产物阻遏,末端代谢产物阻遏,在直线反应途径中，末端产物阻遏较为简单，即产物作用于代谢途径中的第一个酶，使后续的酶都不能合成。,特点：“公共酶”仅受所有分支途径末端产物的共同阻遏（多价阻遏作用）。只有所有末端产物同时累积，才能阻遏“公共酶”合成。芳香簇氨基酸、天冬氨酸簇及丙酮酸簇氨基酸生物合成中的反馈阻遏就属于这种类型。,分支代谢途径的阻遏较为复杂。每种末端产物仅专一地阻遏各自对应的分支途径中酶的合成。,分解代谢物阻遏

5、,细胞内同时存在两种底物(碳源或氮源)时，易利用底物会阻遏难利用底物分解酶系的合成。,如E.coli培养在含乳糖和葡萄糖的培养基上时形成“二次生长现象”，即葡萄糖存在时阻遏了分解乳糖酶系的合成，此现象又称葡萄糖效应。,实质：易利用底物分解过程中产生的中间代谢物或末端代谢物的过量累积，阻遏了代谢途径中一些酶的合成。,酶合成调节的机制操纵子假说,操纵子（operon）：是原核生物基因表达与调控的一 个完整单位，包括结构基因，调节基因，操 作子和启动子。,结构基因(structural genes)：编码蛋白质的DNA序列可根据其上的碱基顺序转录出相应的mRNA，然后再通过核糖体转译出相应的酶,启动

6、子(promoter)：被RNA多聚酶识别的碱基序列，该序列既是RNA聚合酶的结合部位，也是转录起始点,操作子（operator）：位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，是阻遏蛋白（一种调节蛋白）的结合位点，能通过与阻遏物相结合来决定结构基因的转录是否能进行,调节基因（regulator gene）：编码组成型调节蛋白的基因，一般远离操纵子,但在原核生物中,可以位于操纵子旁边,诱导物是起始酶诱导合成的物质，如乳糖等，它们可与调 节蛋白结合，抑制其与操纵基因的结合，从而促进转录的进 行。,辅阻遏物是阻遏酶产生的物质，如氨基酸和核苷酸等，它们也可与调节蛋白结合，促进其与操纵基因的结合，从 而抑

7、制转录的顺利进行。,诱导物与辅阻遏物都属于一类低分子量的信号物质-效应物(如糖类及其衍生物，氨基酸及核苷酸等)，它们均可与调节 蛋白结合，使之发生变构，以提高或降低调节蛋白与操纵基 因的结合能力。,特点：属于低分子量变构蛋白；具有两个结合位点，一个与操作子结 合，另一位点可与效应物结合。,类型：阻遏物，它能在没有诱导物时单独与 操纵基因结合；阻遏物蛋白，它只能在辅阻遏物存在时 才能与操纵基因结合。,定义：由调节基因编码产生的特异性调节蛋白。,酶合成调节的机制,负调控:是指在没有调节蛋白时基因表达具有转录活性，一旦加入调节蛋白，则基因活性被关闭，转录受到 抑制的现象。负调控中的调节蛋白叫阻遏蛋白

8、。,意 义：负调控实际上是一种保安机制，万一在调节蛋白 失活时，酶系统仍然可以合成，使细胞不至于因缺乏 该酶系统而造成致命的后果。,E.coli 乳糖操纵子的负调控,O,E.coli 乳糖操纵子的正调控（分解代谢物阻遏）,现象：当细胞内同时存在两种可利用底物（碳源或氮 源）时，利用快的底物会阻遏与利用慢的底物 有关的酶合成。,原因：阻遏并不是由于快速利用底物直接作用的结果，而是由这种底物分解过程中产生的中间代谢物引 起的，所以称为分解代谢物阻遏。,葡萄糖效应与二次生长现象,单独加入葡萄糖时，菌体生长几乎没有延迟期；单独加入乳糖时，菌体生长有明显的延迟期,同时加入葡萄糖和乳糖时，菌体呈二次生长,

9、乳糖操纵子模型解释分解代谢物的阻遏机制,乳糖与葡萄糖同时存在时，由于分解葡萄糖的酶类属于组成酶，能迅速地将葡萄糖降解成某种中间产物（X），X既会阻止ATP环化形成cAMP，同时又会促进cAMP分解成AMP，从而降低了cAMP的浓度，继而阻遏了与乳糖降解有关的诱导酶合成。,只有当葡萄糖耗尽后，cAMP才能回升到正常浓度，操纵子重新开启，并开始利用乳糖作为碳源，形成菌体的二次生长。,E.coli Trp操纵子-末端代谢产物阻遏的机制,色氨酸操纵子的调节模型,E.coli Trp操纵子弱化调节机制,色氨酸的合成涉及到有7个基因的参与。其中，trpE和trpD编码邻氨基苯甲酸合酶，trpC编码吲哚甘油

10、磷酸合酶，trpA和trpB则分别编码色氨酸合酶的和亚基。trpE基因是第一个被翻译的基因，和trpE紧邻的是启动子区和操纵区。另外，前导区和弱化子区分别定名为trpL和trpa（不是trpA）。trp操纵子中产生阻遏物的基因是trpR，该基因距trp基因簇很远。,色氨酸贫乏时，核糖体停在UGG(54-56)，聚合酶通过，酶合成；色氨酸充足时，转录至UGA(69-71)，不利于RNA聚合酶通过，酶不合成。,3.2 酶活性的调节,通过改变现成的酶分子活性来调节新陈代谢的速率的方式。是酶分子水平上的调节，属于精细的调节。包括两种方式：,酶活性的激活 代谢途径中后面的反应可被较前面的反应产物所促进的

11、现象；常见于分解代谢途径。如：粗糙脉孢霉的异柠檬酸脱氢酶的活性受柠檬酸促进,天门冬氨酸转氨甲酰酶受ATP激活，受CTP抑制（终产物）。,酶活性的抑制,竞争性抑制 抑制剂与反应底物竞争，从而阻止底物与酶的结合。因此，酶反应速度下降。这是一种最常见的可逆抑制作用。可以通过增加底物浓度来解除这种抑制。典型的例子：丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制。,反馈抑制（负反馈）主要表现为某代谢途径的末端产物过量时可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性。主要表现在氨基酸、核苷酸合成途径中。特点：作用直接、效果快速、末端产物浓度降低时又可解除。,3.2.1 反馈抑制的类型,在分支代谢途径中，反馈抑制的情况较为复杂，为了避

12、免在一个分支上的产物过多时不致同时影响另一分支上产物的供应，微生物发展出多种调节方式。主要有：同功酶的调节，顺序反馈，协同反馈，积累反馈调节等。,(1)直线式代谢途径中的反馈抑制,(2)分支代谢途径中的反馈抑制,同功酶调节isoenzyme,在一个分支代谢途径中，如果分支点以前的一个较早的反应是由几个同功酶催化时，则分支代谢的几个最终产物往往分别对这几个同功酶发生抑制作用。某一产物过量仅抑制相应酶活，对其他产物没影响。如大肠杆菌的天冬氨酸族氨基酸合成的调节。,协同反馈抑制,分支代谢途径中几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式(一个也不能少)。如天冬氨酸族氨基酸合成

13、中天冬氨酸激酶受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制和阻遏。,合作反馈抑制,两种末端产物同时存在时，共同的反馈抑制作用大于二者单独作用之和。如嘌呤核苷酸的合成，磷酸核糖焦磷酸酶受AMP和GMP（和IMP）的合作反馈抑制，二者共同存在时，可以完全抑制该酶的活性。而二者单独过量时，分别抑制其活性的70%和10%。,积累反馈抑制,每一分支途径末端产物按一定百分比单独抑制共同途径中前面的酶，所以当几种末端产物共同存在时它们的抑制作用是积累的，各末端产物之间既无协同效应，亦无拮抗作用。如 E.coli谷氨酰胺合成酶的调节,顺序反馈抑制,一种终产物的积累,导致前一中间产物的积累，通过后者反馈抑制合成途径关键酶的活

14、性，使合成终止。如 枯草芽孢杆菌芳香族氨基酸合成的调节,代谢互锁,一种氨基酸的合成受到另一种完全无关的氨基酸的控制，而且只有当该氨基酸浓度大大高于生理浓度时才能显示抑制作用.如赖氨酸的生物合成与亮氨酸的生物合成之间存在着代谢互锁,在分支合成途径中，分支点后的两种酶竞争同一种底物，如AMP与GMP，Thr与Lys、Met，由于两种酶对底物的Km值（即对底物的亲和力）不同，故两条支路的一条优先合成。,优先合成,3.2.2 酶活力调节的机制变构酶理论,变构酶为一种变构蛋白，酶分子空间构象的变化 影响酶的活性。它具有两个以上立体专一性不同的接受部位，一个是活性中心，另一个是调节中心。,反馈抑制和阻遏的

15、概念反馈抑制：是指代谢途径的终产物对催化该途径中的一个反应（通常是第一个反应）的酶活力的抑制，其实质是终产物结合到酶的变构部位，从而干扰酶和它底物的结合，当然与此相反为酶活性的激活。反馈阻遏：是指终产物（或终产物的结构类似物）阻止催化该途径的一个或几个反应中的一个或几个酶的合成，其实质是调节基因的作用，这是微生物不通过基因突变而适应于环境改变的一种措施，当然与此相反有酶合成的诱导。,3.3 细胞膜通透性的调节,细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的屏障。细胞从外部环境中吸收营养物质或将细胞内代谢产物分泌至细胞外，都要通过细胞膜。细胞通过对膜透性大小的调节实现对代谢过程的部分调节。,（1）通过细胞

16、膜缺损突变而控制其渗透性：筛选透性突变株。,（2）解除反馈抑制,当细胞膜完整时，透性小，细胞内的某代谢产物不能及时分泌到细胞外部，在细胞内不断累积，至其浓度达到一定程度时发生反馈抑制，导致该代谢产物合成减慢或停止。,谷氨酸生产过程发酵液中生物素与谷氨酸含量的关系,此外，加入青霉素等抗生素和吐温80等脂肪酸衍生物，都能增大膜的通透性，从而促进细胞内谷氨酸向细胞外大量分泌，以解除反馈抑制。,4.代谢的人工控制及其在发酵工业中的应用,基本方法：,遗传学方法-改变微生物遗传特性,生物化学方法-控制发酵条件,工业发酵的目的大量地积累人们所需要的微生 物代谢产物。,代谢的人工控制人为地打破微生物的代谢控制

17、体 系，就有可能使代谢朝着人们希望的方向进行。,4.1 遗传学方法,营养缺陷型菌株的应用,对于直线式代谢途径：选育营养缺陷性突变株只能积累 中间代谢产物。典型例子：,利用谷氨酸棒状杆菌的精氨酸缺陷型突变株进行鸟氨酸发酵。,分支代谢途径：情况较复杂，可利用营养缺陷性消除协同反馈抑制积累末端产物，亦可利用双重缺陷发酵生产中间产物。,赖氨酸发酵,高丝氨酸营养缺陷型菌株生产赖氨酸的合成途径,肌苷酸发酵,谷氨酸棒状杆菌的腺核苷酸和鸟苷酸的合成途径,渗漏突变株(leakage mutant)的应用,这是一种不完全遗传障碍营养缺陷型，能自己合成微量的某一代谢终产物，但达不到反馈抑制的浓度，所以不会造成反馈抑

18、制而影响中间代谢产物的积累。与营养缺陷型不同的是不需要外源添加渗漏缺陷的物质。,如利用Hserl解除（Thr+Lys)对天冬氨酸激酶(AK)的协同反馈抑制：Hserl细胞能合成Hser，但合成的量仅能维持细胞的最低生长，胞内的浓度达不到进行反馈调节的浓度。,抗反馈调节突变株的应用,抗反馈抑制突变型,由于结构基因突变而使变构酶不能和代谢终产物结合，从而失去反馈抑制的突变型。,抗反馈阻遏突变型,由于调节基因突变引起调节蛋白不能和代谢终产物结合，从而失去阻遏作用的突变型。,抗反馈调节突变株：是指一种对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性的组成型突变株，或兼而有之的突变株。结构类似物 analog（抗代谢物a

19、ntimetabolite）是一种与初级代谢产物结构类似但缺乏生理功能的化合物,黄色短杆菌苏氨酸、赖氨酸和异亮氨酸的合成途径及反馈调节,抗结构类似物突变株的应用的典型例子,结构基因不受控制地转录，酶的生成将不再需要诱导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏。,调节基因发生突变,产生无效的阻遏物而不能与操纵基因结合,操纵基因突变,突变操纵基因不能与阻遏物结合,组成型突变,组成型突变株的应用,1.添加前体绕过反馈控制点：亦能使某种代谢产物大量产生,2.控制发酵的培养基成分：工业生产的酶大多受分解阻遏或分解抑制的控制，因此，在培养基中避免使用可阻遏的碳源或氮源。如嗜热芽孢杆菌的淀粉酶的合成受果糖的阻遏，

20、如采用甘油做碳源，可大大促进酶的生产。,4.2 生物化学方法,通过添加C，可大量积累D,3.限量营养物的添加，或抗生素的加入以增加细胞膜透性 如谷氨酸生产，添加适量生物素，可增加生产菌细胞膜透性，使产物Glu不断分泌到胞外。从而解除了过量Glu对谷氨酸脱氢酶的反馈抑制作用，提供其产量。如添加青霉素，以抑制细胞壁的合成，造成细胞膜透性增加，Glu就能大量分泌到胞外。4.发酵与分离过程耦合,5.微生物次级代谢产物的代谢调控,次级代谢与初级代谢的关系,存在范围及产物类型不同,初级代谢是一类普遍存在于各类生物中的一种基本代谢类型。次级代谢只存在于某些生物（如植物和某些微生物）中，并且代谢途径和代谢产物

21、因生物不同而不同，即使同种生物也会由于培养条件的不同而产生不同的次级代谢产物。如产黄青霉在在Raulin中培养时可以合成青霉酸。但在CzapekDox中培养则不产青霉酸。,初级代谢产物，如单糖或单糖衍生物、核苷酸、脂肪酸等单体以及由它们组成的蛋白质、核酸、多糖、脂类等通常都是机体生存必不可少的物质，只要在这些物质的合成过程的某个环节上发生障碍，轻则引起生长停止、重则导致机体发生突变或死亡。而次级代谢产物对于产生者本身来说，不是机体生存所必需的物质，即使在次级代谢的某个环节上发生障碍,也不会导致机体生长的停止或死亡，至多只是影响机体合成某种次级代谢产物的能力。,对产生者自身的重要性不同,初级代谢

22、自始至终存在于一切生活的机体中，同机体的生长过程呈平行关系；次级代谢则是在机体生长的一定时期内（通常是微生物的对数生长期末期或稳定期）产生的，它与机体的生长不呈平行关系，一般可明显地表现为机体的生长期和次级代谢产物形成期二个不同的时期。,同微生物生长过程的关系明显不同,对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同,初级代谢对环境条件的变化敏感性小（即遗传稳定性大），而次级代谢对环境条件变化很敏感，其产物的合成往往因环条件变化而停止。,相关酶的专一性不同,相对来说催化初级代谢产物合成的酶专一性强，催化次级代谢产物合成的某些酶专一性不强，因此在某种次级代谢产物合成的培养基中加入不同的前体物时，往往

23、可以导致机体合成不同类型的次级代谢产物，,某些机体内存在二种既有联系又有区别的代谢类型,初级代谢是次级代谢的基础，它可以为次级代谢产物合成提供前体物和所需要的能量；初级代谢产物合成中的关键性中间体也是次级代谢产物合成中的重要中间体物质。而次级代谢则是初级代谢在特定条件下的继续与发展，避免初级代谢过程中某种（或某些）中间体或产物过量积累对机体产生的毒害作用。,初级代谢与次级代谢的关系,次级代谢产物生物合成与初级代谢产物的关系,酶合成的诱导调节 参与次生代谢的酶，有些酶也是诱导酶，以底物或底物类似物（内源、外源）为诱导剂。反馈调节 包括次级代谢物的自身反馈调节、前体物的反馈调节、初级代谢产物的调节

24、,次生代谢的主要调节机制,赖氨酸对青霉素生物合成的调节,分解代谢产物调节 碳分解产物调节 按被菌体利用速度的不同，碳源可分为迅速利用的碳源和 缓慢利用的碳源。快速利用的碳源对很多产物的生物合成产生阻遏作用；缓 慢利用的碳源，有利于延长代谢产物的合成。在工业上，发酵培养基常采用含迅速和缓慢利用的混合碳 源，来控制菌体的生长和产物的合成。,氮分解产物调节 速效氮源(如氨基酸和玉米浆等)促进菌体生长，但对某些 抗生素的生物合成产生抑制或阻遏作用，降低产量。迟效氮源(黄豆饼粉、花生饼粉等)对延长次级代谢产物的 分泌期，提高产物的产量有利。但一次投入过多，容易促 进菌体生长和养分过早耗尽，缩短产物的分泌

25、期。在工业上，发酵培养基一般选用含有快速和慢速利用的混 合氮源。而且，在发酵过程中限量补加氮源来控制其浓度 a.补加某些具有调节生长代谢作用的有机氮源，如酵母 粉、玉米浆、尿素等。b.补加氨水或硫酸铵等无机氮源.当pH偏低又需补氮时，可通入氨气；当pH偏高又需补氮时，可加入生理酸性物 质如硫酸铵等。,磷酸盐调节 磷酸盐在微生物的生长和次级代谢产物合成中起着重要 的作用，高浓度的磷酸盐对抗生素等次级代谢产物的合 成表现出较强的抑制作用。适合微生物生长的磷酸盐浓 度是0.3300mmol，10mmol的磷酸盐就明显地抑制次级 代谢产物的合成。磷酸盐对初级代谢产物合成的调节往往是通过促进生长 而间接

26、产生的，对次级代谢产物生物合成的调节有多种 可能的机制，主要包括抑制酶的活性，如在链霉素合成 中，高浓度磷酸盐抑制碱性磷酸脂酶的活性；导致细胞 内能荷变化；或提高磷酸盐竞争某些必须金属离子的作 用。,细胞生长调节 在生长期中，负责合成抗生素的酶被全部或部分抑制。进入生产期后，死亡的细胞数与增殖的细胞数保持相对平衡，合成菌体成分的代谢很慢，抗生素开始急速形成，直至其合成能力的衰退。细胞膜透性的调节 如谷氨酸生产，添加适量生物素，可增加生产菌细胞膜透性，使产物Glu不断分泌到胞外。从而解除了过量Glu对谷氨酸脱氢酶的反馈抑制作用，提供其产量。,次级代谢的调控以青霉素G的发酵生产为例,青霉素的生物合成与碳源分解代谢产物的关系,青霉素的生物合成与赖氨酸的反馈调节,复习题,1.在化能异养微生物的生物氧化中，其基质脱氢和产能途径主要有哪几条？试比较各途径的主要特点。2.试比较有氧呼吸、无氧呼吸和发酵的异同点。3.微生物调节代谢流的主要方式有哪两类？反馈抑制有哪几种类型？,