微生物遗传变异与菌种保藏增加内容.ppt

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1、第八章 微生物遗传变异与菌种保藏(增加内容),本章内容:第一节 遗传的物质基础第二节 基因突变及修复第三节 基因重组第四节 微生物诱变育种第四节 菌种的衰退、复壮及保藏,第一节 基因突变与诱变育种,一、基因突变二、突变与育种三、营养缺陷型的筛选,一 基因突变,(一)突变类型(二)突变的特点(三)基因突变自发性及不对应性证明(四)基因突变的机制(五)DNA的损伤及修复,(一)突变类型,细胞形态 1、形态突变型 菌落形态 营养缺陷型 2、生化突变型 抗性突变型 抗原性突变(包括细胞内部、表面成分的改变),3、致死性突变型(合成关键性酶的基因发生了突变,则表现出致死突变)条件致死突变型 如突变为温度

2、敏感型突变(37死,25活)4、其它突变型 毒力突变、糖发酵突变、产量、产品突变等。,(二)突变的特点,1 非对应性:环境与变异无对应性。2 自发性:非人为的诱变因素下发生。3 规律性:某一特定性的突变率具规律性。4 独立性:一个基因的突变对其它基因突变无影响。5 稀有性:生物自发突变率为10-610-12。6 诱变性:诱变剂可提高突变率10105X。7 稳定性:突变性状稳定、可遗传。8 可逆性:有回复突变。,(三)基因突变自发性及不对应性的证明(自学),自发突变:没有人工诱变因素的参与,生物体自然突变。1、彷徨试验:2、涂布试验:3、平板影印(Replica plating)培养试验:,彷徨

3、试验,(1)抗性细胞的出现,是在接触噬菌体之前(2)喷上噬菌体,仅起淘汰野生型和鉴别抗性株作用;(3)于甲方高度彷徨,说明突变是随机的。,平板影印培养试验,(1)突变与噬菌体无关;(2)涂布使抗性菌株均匀分布;(3)抗性突变可在任何时间发生,与噬菌体存在无关。以上实验用统计学原理间接证明。,影印培养试验,(1)实验表明:从未接触 str 的菌株可发生抗性突变,分离可得到纯的 str 菌株。(2)由此表明:突变是自发的与环境不对应的。,(四)基因突变的机制(自学),1 DNA的复制(核苷酸对掺入错误)微生物自身产生诱变物质(咖啡碱、硫氢化合物、重氮丝氨酸等)环境对微生物的诱变作用(辐射、加热等)

4、,(五)DNA损伤及修复(自学),1 光复活作用2 切除修复3 重组修复4 SOS修复,二 突变与育种,(一)自发突变与生产育种(二)诱变育种,(一)自发突变与生产育种,1.生产选育:群体培养中个别的变异个体表现出生长优势,发现突变种后,随时分离、纯化。2.定向培育:用特定的环境长期处理某一微生物群体,同时不断对其移种、传代,以达到积累和选择合适的自发突变 体的一种育种方法。,(1)自发突变(spontaneous):在非人为的情况下由于遗传物质的微小变化引起的性状变异。(2)原因可能是:1)环境因素;2)自身有毒产物的积累;3)互变异构效应;,3、自发突变的机制,二 诱变育种,1、概念2、诱

5、变剂3.诱变程序4、诱变的主要环节,1、概念 诱变育种是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质(DNA)的分子结构发生改变,引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。,(1)概念:凡能提高基因突变频率的理化因素。(2)种类:1)物理因子(phisical agents)物理诱变剂:U.V、快中子、超声波等。2)化学因子(chemical agents)3)转座子(transposable elements),2、诱变剂,烷化剂(alkylating agents):如:氮芥、硫酸二乙酯、亚硝基胍、NTG等 机制:将烷烃加在含氮碱基上,改变氢键性质。,化学诱变剂:,碱基类似

6、物(base analogs):如:叠氮胸腺嘧啶(AIT)等;机制:在DNA复制时将碱基类似物插入DNA中,而碱基 类似物没有正常碱基的氢键性质,在DNA复制时 出现突变体。,插入剂(intercalating agents):如:溴化乙啶等一些三环分子。机制:与DNA中的一对碱基有大致相同的位点,这些分子不改变碱基的氢键性质,而插入在双螺旋中,加宽间距,引起碱基增加。t,3.诱变程序:,原始菌种 原菌种特性鉴定 纯化 斜面/肉汤 培养单孢子/单细胞悬液 诱变剂处理 计算存活率 平板分离 观察形态变异,挑单菌落 移至斜面 初筛 复筛 小试 良种保藏 中试,4 诱变的主要环节,(1)诱变剂的选择

7、(2)出发菌株的选择(3)单孢子或单细胞悬液的制备(4)设计和采用效率高的筛选方案和方法,(1)诱变剂的选择:1)了解诱变剂的性质、作用机理和使用方法。2)处理方式 A、单一因子处理:先后使用 B、复合因子处理:两种以上因素同时使用单一 因子重复使用。3)处理剂量:测致死率。方法:平板菌落计数法、纸片法 一般杀菌率为70%左右。,(2)出发菌株:育种的原始菌种应具备:1)对诱变剂的敏感性高;2)生产中选育过的自发变异菌株;3)本身具有一些有利性状;4)对代谢产物有一定积累;5)已经发生过某些变异。,(3)单孢子或单细胞悬液的制备 1)必要性:单细胞可均匀地接触诱变剂,避免出现不纯的菌落菌种退化

8、。2)制备:物理诱变剂生理盐水(0.85%NaCl)化学诱变剂缓冲液。3)方法:三角瓶内加0.5cm玻璃珠打散10-15min;加.3%吐温80(表面活性剂),用无菌脱脂棉过滤。4)浓度:细菌、放线菌 108个/ml 霉菌、酵母菌 106个/ml,(4)设计和采用效率高的筛选方案和方法 1)初筛:平板上做定性、半定量的测定,观察突变株的生理效应范围。方法 梯度平板法(抗性菌株)纸片法(抗性菌株)透明圈法(淀粉酶产生菌株等)变色圈法(氨基酸生产菌株)2)复筛:(见P250)较精确的生物化学分析方法做摇瓶测定,三、营养缺陷型的筛选,(一)概念(二)筛选方法,(一)概念,1.三种遗传型个体2、筛选用

9、的培养基,1.三种遗传型个体,(1)营养缺陷型(auxotroph):经诱变产生的一些合成能力出现缺陷,而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。如:lys-;bio-;(2)野生型(wild type):自然界分离到的任何微生物,在其发生营养缺陷突变前的原始菌株,为该微生物的野生型。如:lys+;bio+;(3)原养型(prototroph):指auxo突变菌株回复突变或重组后产生的菌株,与野生型的表型相同。,2、筛选用的培养基,1)基本培养基(minimal medium,MM)-:满足野生型菌株营养要求最低成分的组合。2)完全培养基(complete medium,CM)+

10、:满足一切auxo生长的天然或半组合培养基。3)补充培养基(supplemented medium,SM)x:在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应 auxo生长的组合培养基。,(二)筛选方法,1、诱变处理2、auxo的浓缩3、auxo的检出4、auxo的鉴定5、auxo的应用,1.诱变处理(同前),auxo的筛选程序:细菌培养 离心洗涤 诱变处理 CM后培养 洗涤 MM加PN 涂布于CM平板 影印培养 挑取 鉴定 菌种保存。,2.auxo的浓缩:,(1)抗生素法:1)原理:青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着的微生物细胞,对休止态细胞无作用。2)方法:菌培养在含抗生素的MM基中。(

11、2)菌丝过滤法:1)适用于丝状(放线菌、霉菌)2)原理:基本培养基上只有发育成菌丝;auxo孢子可通过滤膜,野生型菌丝不能通过。(3)差别杀菌法:基本培养基上只有野生型生长,加热杀死野生型营养体,保留auxo芽孢。细菌80 酵母60 适用于产芽孢、孢子菌。,3.auxo的检出,(1)逐个检出法(2)影印平板培养法(3)限量补充法(在mm中加0.01%蛋白胨,auxo菌落小,野生型大)(4)夹层培养法,4.auxo的鉴定,(1)生长谱法 1)方法简便;2)回变和污染不影响结果 3)测定物质可为粉末或纸片(2)混合氨基酸(Vit)法混合氨基酸法步骤:1)将多种营养因子编组,如:2)将组合液的纸片放

12、在涂菌的基本培养基上培养 3)结果分析4)营养因子分组编排时注意:A、每组内无重复的营养因子 B、每组中应包含只出现一次的因子 C、每组中其他因子应分别出现二次,一组:1 2 3 4 5 二组:2 6 7 8 9 三组:3 7 10 11 12 四组:4 8 11 13 14 五组:5 9 12 14 15,5.auxo 的应用,(1)作为标记菌株:进行基因工程、诱变育种、代谢过程的研究中的亲本标记;(2)作为生产菌种:aa、核苷酸等生产菌种;(3)作为aa、维生素、碱基的测定菌株。,第二节 基因重组,一、原核生物的基因重组 二、真核生物的基因重组,基因重组把两个不同性状个体内的遗传基因转移到

13、一起,经遗传物质重新组合后,形成新遗传型个体的方式。基因重组分子水平的杂交 一般杂交细胞水平,如:甲 乙生长快、产量低 生长慢、产量高 基因重组 生长快、产量高,一、原核生物的基因重组,(一)转化(transformation)(二)转导(transduction)(三)接合(conjugation)(四)原生质体融合(protoplast fusion),(一)转化(transformation),概念 受体细胞(receptor)直接吸收了来自供体细胞(donor)的DNA片断,并把它整合到自己的基因组中,细胞部分遗传性状发生变化的现象叫转化。,1.感受态2.感受态因子3.转化因子4.转化

14、的检出,(1)感受态:受体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。(2)转化的决定因素:不同菌株的亲缘关系;受 体细胞是否处于感受态;不同菌出现感受态的时间不同。,1.感受态,一种胞外蛋白质,分子量为510kD其作用为:(1)催化转化,促进外来DNA片段吸收。(2)可降解细胞表面某种成分,使DNA受体暴露。1)不同菌细胞DNA受体位点不同。2)有的菌感受态因子只对同种菌起作用。,2.感受态因子,3.转化因子,(1)转化因子由供体提供(2)一般为线状或闭合环状;单链或双链;双链 有转化能力,单链没有。(3)自然情况下可由细菌细胞自行裂解产生;实验室里 通过提取获得。(4)转化的频率往往很低,一般为0.11%。据研究,呈质粒形式(双链闭合环状)的转化因子,其转化频率最高。,游离的片断叫转化因子,4.转化的检出,甲-受体strr,lys-在含str的MM上培养乙-供体strs,lys+如出现strr,lys+的菌株,则表明已经转化。,

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