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1、膜片钳技术与应用重庆医科大学儿童医院儿研所陈恒胜,第一部分：膜片钳基础及原理第二部分：膜片钳实验系统组成第三部分：膜片钳实验基础第四部分：膜片钳的应用,细胞膜的结构和离子通道：细胞膜由脂质双分子层和蛋白质组成，蛋白质又包括整合蛋白和表面蛋白。,离子通道是一种特殊的膜蛋白，它横跨整个膜结构，是细胞内部与部外联系的桥梁和细胞内外物质交换的孔道，当通道开放时，细胞内外的一些无机离子如Na,k Ca 等带电离子可经通道顺浓度梯度或电位梯度进行跨膜扩散，从而形成这些带电离子在膜内外的不同分布态势，这种态势和在不同状态下的动态变化是可兴奋细胞静息电位和动作电位的基础。这些无机离子通过离子通道的进出所产生的
2、电活动是生命活动的基础，只有在此基础上才可能有腺体分泌、肌肉收缩、基因表达、新陈代谢等生命活动。离子通道结构和功能障碍决定了许多疾病的发生和发展。因此，了解离子通道的结构、功能以及结构与功能的关系对于从分子水平深入探讨某些疾病的病理生理机制、发现特异性治疗药物或措施等均具有十分重要的理论和实际意义.,如何研究离子通道对离子通道的研究主要从结构、功能以及结构与功能的关系三方面进行研究1.结构研究：分子生物学方法确定蛋白质序列；X光绕射方法确定其三维立体结构。2.功能研究：电生理测定通过离子通道的电流或测量细胞膜电流或膜电位的变化，反映离子通道个体或群体的分子活动。3.结构和功能相结合：利用基因突
3、变技术在一级结构的特定部位删除、添加或改变残基的序列，然后检测突变后的功能改变。,离子通道结构研究：目前，绝大多数离子通道的一级结构得到了阐明，但最根本的还是要搞清楚各种离子通道的三维结构，在这方面，美国的二位科学家彼得阿格雷和罗德里克麦金农做出了一些开创性的工作，他们利用X光绕射方法得到了K离子通道的三维结构，二位因此获得2003年诺贝尔化学奖。有关离子通道结构不是本PPT的重点，可参考杨宝峰的离子通道药理学和Hill的 Ionic Channels Of Excitable Membranes.,离子通道功能观察的两种技术对离子通道功能的研究，主要采用记录离子通道电流来间接反映离子通道功能
4、，目前有如下两种技术电压钳(Voltage clamp)技术膜片钳(patch clamp)技术,电压钳技术(Voltage Clamp)：电压钳技术，是20世纪初由Cole发明，Hodgkin和Huxley完善，其设计的主要目的是为了证明动作电位的产生机制，即动作电位的峰电位是由于膜对钠的通透性发生了一过性的增大过程。但当时没有直接测定膜通透性的方法，于是就用膜对某种离子的电导来代表该种离子的通透性，膜电导测定的依据是电学中的欧姆定律，如膜的Na电导GNa与电化学驱动力（Em-ENa)和膜电流INa的关系GNa=INa/（Em-ENa).因此可通过测量膜电流，再利用欧姆定律来计算膜电导，但是
5、，利用膜电流来计算膜电导时，记录膜电流期间的膜电位必须保持不变，否则膜电流的变化就不能代表膜电导的变化。这一条件是利用电压钳技术实现的。下张幻灯中的右边两张图是Hodgkin和Huxley在半个世纪以前利用电压钳记录的抢乌贼的动作电位和动作电位过程中的膜电流的变化图，他们的实验首次证明参与动作电位的离子流由Na,k,漏（Cl）三种成分组成。并对这些离子流进行了定量分析。这一技术对阐明动作电位的本质和离子通道的的研究做出了极大的贡献。,cole,K+电流,Na+电流,电压钳的原理：用两根尖端直径0.5um的电极插入细胞内，一根电极用作记录电极以记录跨膜电位，用另一根电极作为电流注入电极，以固定膜
6、电位。从而实现固定膜电位的同时记录膜电流。电位记录电极引导的膜电位（Vm）输入电压钳放大器的负输入端，而人为控制的指令电位（Vc）输入正输入端，放大器的正负输入端子等电位，向正输入端子施加指令电位（Vc）时，经过短路负端子可使膜片等电位，即Vm=Vc,从而达到电位钳制的目的，并可维持一定的时间。Vc的不同变化将导致Vm的变化，从而引起细胞膜上电压依赖性离子通道的开放，通道开放引起的离子流反过来又引起Vm的变化，致使VmVc,Vc与Vm的任何差值都会导致放大器有电压输出，将相反极性的电流注入细胞，以使Vc=Vm，注入电流的大小与跨膜离子流相等，但方向相反。因而注入的电流被认为是标本兴奋时的跨膜电
7、流值（通道电流）。,指令电位（Vc),+,_,Vo,电位记录电极（Vm),电流注入电极(I),电压钳的缺点：电压钳技术目前主要用于巨大细胞的全细胞电流研究，特别在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定中发挥其它技术不能替代的作用。但也有其致命的弱点：1、微电极需刺破细胞膜进入细胞，以致造成细胞浆流失，破坏了细胞生理功能的完整性；2、不能测定单一通道电流。因为电压钳制的膜面积很大，包含着大量随机开放和关闭着的通道，而且背景噪音大，往往掩盖了单一通道的电流。3、对体积小的细胞(如哺乳类中枢神经元，直径在1030m之间)进行电压钳实验，技术上有更大的困难。由于电极需插入细胞，不得不将微电极的尖端做得很细，
8、如此细的尖端致使电极阻抗很大，常常是608OM或120150M（取决于不同的充灌液）。这样大的电极阻抗不利于作细胞内电流钳或电压钳记录时在短时间（0.1s）内向细胞内注入电流，达到钳制膜电压或膜电流之目的。再者，在小细胞上插入的两根电极可产生电容而降低测量电压电极的反应能力,膜片钳（Patch Clamp)：在利用电压钳观测了动作电位期间膜电导的变化之后，人们一直想搞清楚膜电导变化的机制，当时的实验证明，离子的跨膜流动的速度很快，膜电导又具有离子选择性，并可被某些药物特异性地阻断，这些现象提示离子可能是通过一些专一性的“孔道”样结构通过细胞膜的，于是提出了“离子通道”的假设。为了证实离子通道的
9、存在，也为了克服电压钳的缺点，Erwin Neher和 Bert Sakmann在电压钳的基础上发明了膜片钳（patch clamp）。并利用该技术首次在蛙肌膜上记录到PA级(10-12A)的乙酰胆碱激动的单通道电流,首次证明了离子通道的存在.并证明在完整细胞膜上记录到的膜电流是许多单通道电流总和的结果。这一技术的问世，给细胞生物学的研究带来了一场革命，被誉为与分子克隆技术并驾齐驱的划时代的伟大发明。二人因此而获得诺贝尔生理或医学奖。,(Neher),(Sakmann),膜片钳是从Patch Clamp的翻译，Patch是小片，小块的意思，这里指膜片，这个膜片可大可小，大到整个细胞膜，小到细胞
10、膜上的一平方微米，Clamp是钳，夹的意思，这里指固定，钳制的意思，指通过将patch上的膜电位人为地控制在某一水平，或从一个水平瞬间跃迁到另一水平，从而记录patch上的单个离子通道或整个细胞膜上某一种类的离子通道的电流，从而通过记录离子通道电流来反映离子通道的功能,膜片钳（Patch Clamp)的基本原理：利用尖端直径0.5-1um的玻璃电极吸附到细胞膜表面，通过负压吸引使电极尖端和细胞膜形成紧密封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜小片区域（patch）与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定膜电位(clamp)，然后对电极尖端下面积仅为几平方微米的细胞膜片上一个或几个离子通道的电流进行记录。
11、从而将电生理学技术提高到记录和研究单个蛋白质的分子水平,核心部分是一场效应管运算放大器构成的I-V转换器，他的正负输入端子为等电位。向正输入端子施加指令电位（Vc）时，经过短路负端子可使膜片等电位，从而达到电位钳制的目的。离子通道电流可作为I-V转换器内的高阻抗反馈电阻的电压降而被检测出。,根据实验要求，可组建不同的实验系统。但也有一些共同的基本组成部件，其中包括电子学部件:放大器；计算机接口，数据采集、分析系统。光学部件和光电接口：显微镜；监视器等。机械系统:防震台等。辅助系统：电极拉制器；切片机；孵育槽；灌流系统等,第二部分:膜片钳实验系统组成,电子学部件：由于膜片钳检测的是PA级的微电流
12、信号，因此需要特殊的放大器及模数转换器，目前国内使用的主流放大器主要是美国AXON公司的200B和Multiclamp700B放大器及德国HEKA公司的EPC10放大器。200B是电容反馈式放大器，噪声低，适合做单通道膜片钳，Multiclamp700B和EPC10可通过软件进行操作，自动化程度高。,200B,MDC(原Axon)公司,MultiClamp700B,光学部件和光电接口：膜片钳实验是一个微操作实验，需在显微镜下进行玻璃电极和细胞的封接，因此需要高质量的显微镜和成像系统，如果所用的细胞是培养的单个细胞，需要一台倒置相差显微镜，而如果所用的标本是脑片或其他组织片，所用的光学系统必须是
13、红外微分干涉差成像系统，这样才能“看”到组织中的单个的细胞，才能在可视条件下进行组织膜片钳的操作。,机械系统:由于膜片钳实验是一个微电和微操作实验，任何微小的震动都会影响电极和细胞的封接，导致实验的失败，因此一台高质量的防震台是必须的。,辅助系统：膜片钳实验系统是一个综合性的集成系统，除了上面提到的几大系统外，相关的辅助系统也是必不可少的，辅助系统的设备好坏，很大程度上左右着实验能否顺利开展，有的实验室主要系统配置十分主流，而辅助系统则凑合，这将极大的影响实验，所谓细节决定成败，用在膜片钳实验中是十分贴切的。,Sutter公司微电极拉制器,P-97,P-2000,日本成茂公司微电极拉制器和抛光
14、仪,软件系统：目前的数据采集和分析软件系统主要是Axon公司的Pclamp软件和HEKA公司的Patch Master软件。在实验后期文章发表中还涉及到一些图形处理软件，如Origin等软件。,MDC公司Pclamp采集和分析软件,第三部分：膜片钳实验基础前面两部分介绍了膜片钳技术的原理及膜片钳的系统组成，在此基础上本部分简要介绍：膜片钳放大器的工作模式膜片钳的记录方式膜片钳实验基本过程膜片钳记录的信息,膜片钳放大器的工作模式：(1).电压钳模式：在钳制细胞膜电位的基础上改变膜电位，记录离子通道电流的变化，记录的是诸如通道电流；EPSC;IPSC等电流信号。是膜片钳的基本工作模式.(2).电流
15、钳模式:向细胞内注入刺激电流，记录膜电位对刺激电流的反应。记录的是诸如动作电位，EPSP;IPSP等电压信号。,细胞贴附式,全细胞记录式,外面向外式,内面向外式,膜片钳的几种记录模式极其形成：,各种记录模式的形成过程,各种记录方式的用途及其优缺点：,膜片钳实验的基本过程：1、液体配制：主要根据研究通道的不同，配制相应的液体，基本原则是保持两个平衡：渗透压平衡和酸碱平衡。所有液体在使用前必须过滤。2.标本制备3.记录4、资料分析：（1）一般电学性质：通过I-V关系计算单通道电导，观察通道有无整流。通过离子选择性、翻转电位或其它通道激活条件初步确定通道类型。（2）动力学：开放时间、开放概率、关闭时
16、间、通道的时间依赖性失活、开放与关闭类型（簇状猝发（Burst）样开放与闪动样短暂关闭（flickering），化学门控性通道的开、关速率常数等。（3）通过对全细胞激活曲线或失活曲线的分析，可得到半数激活或失活电压Vh及斜率因子K。（4）药理学：阻断剂、激动剂或其它调制因素对通道活动的影响。（5）综合分析得到最后结论。,a,膜片钳使用的标本 1.单细胞：急性分散细胞和培养细胞2.脑片或组织块。3.整体动物。要求：膜片钳80%的工夫在于制备细胞。细胞表面要干净,不能有胶质细胞等蛋白质物质。细胞状态良好，表面光滑，无麻斑，无肿胀或皱缩。,脑片,单细胞,膜片钳记录的信息,电压钳模式,电流钳模式,1.
17、单通道电流,1.典型的单通道电流呈一种振幅相同而持续时间不等的脉冲样变化。他有两个电导水平，即0和1，分别对应通道的关闭和开放状态。2.有的矩形脉冲簇状发放时，通道电流不在同一水平，可以明显观察到不同数目离子通道所形成的电流台阶，从而可推断出被测膜片的通道数目。3.有的通道可记录到圆滑型和方波形两种形式。4.有些通道开放活动是持续开放，中间被闪动样的关闭所中断，形成burst开放。有些通道开放活动是簇状开放与短期平静交替出现，形成簇状发放串（Cluster),2.全细胞电流,全细胞电流是一些形状各异的电流曲线,3.Glu受体电流,5.mEPSC,4.sEPSC、mEPSC,突触电流,6.神经元
18、动作电位,膜片钳实验的难点：由于膜片钳涉及到大量的理工科的知识，对于生物医学工作者来说，理解起来有一定的难度。单从使用的角度来看，掌握起来并不难，如果在有经验的老师指导下，1-2个星期即可掌握其基本操作。但从实践中来看，许多学生不愿进行有关方面的实验，原因是熟练掌握有关技术确存在一定难度，究其根本原因是许多学生的标本制备技术没过关。由于此项技术首先要使电极和细胞形成高阻封接，而要成功形成高阻封接，除了制备合符要求的电极外，制备活性好的细胞是必须的，要求细胞表面光滑，有弹性，表面无麻斑，但从工作中来看，许多同学制备的标本或多或少存在一些问题，这就极大地影响了实验的成功率，甚至导致实验根本无法进行
19、，而如果有关实验要在脑片上进行，这就涉及到脑片制作，而适用于膜片钳研究的脑片制作尤其是成年动物的脑片制作尤其难，因此，有人说膜片钳的成功80%在于标本的制备，确实有一定道理。传统膜片钳技术每次只能记录一个细胞，而且从找细胞、形成封接、破膜等整个过程都需人工操着，任何一个环节都有可能失败，而如果细胞质量不好，成功率更低，因此，对实验人员来说是一项耗时耗力的工作，即使有经验的人员，一天也只能成功记录10-20个细胞，而脑片实验往往每天只能得到1-2个实验数据，一个实验课题往往要几个月时间才能完成，因此要求实验者要有充裕的时间进行此项工作，如果是学生自己进行有关方面的实验操作，国内有些实验室往往限制
20、临床型的学生进入。,第四部分：膜片钳技术的应用膜片钳如今已成为基础医学和临床医学的常用研究手段，目前膜片钳技术广泛应用于神经（脑）科学、心血管科学、药理学、细胞生物学、病理生理学、中医药学、植物细胞生理学、运动生理等多学科领域研究。以下结合我们的工作，介绍一些应用实例。,细胞特性的研究：细胞的基本特性包括被动膜特性如膜静息电位、膜电阻、膜电容、膜时间常数等。而对于可兴奋细胞还包括细胞的主动膜特性如动作电位的形式、阈值、幅度、频率等.这些指标往往反映细胞的成熟程度，处于不同发育时期的细胞这些指标往往是有差别的。这为我们进行某些疾病的细胞移植治疗的细胞选择提供了一些参考指标。例如，骨髓问充质干细胞
21、(MSCs)具有多向分化的潜能，在体外培养可向心肌细胞分化，目前的研究认为MSCs是干细胞移植治疗心肌梗死的理想细胞资源。MSCs移植治疗心肌梗死能使心功能得到改善，但同时也可能发生心律失常。因此，明确这类MSCs在移植前具有怎样的细胞特性及其发育过程，对移植细胞的选取和干细胞移植后电生理研究具有重要意义，我们的研究发现，MSCs培养4周后其细胞特性比较接近于正常的心肌细胞，因此，笔者认为若以未诱导分化的MSCs做移植，培养4周左右(446代)的细胞不失为良好的细胞选择。而MSCs钾离子电流表达的不均一性或许是导致心律失常产生的原因之一。,离子通道的鉴别：利用膜片钳技术可对细胞表达的离子通道进
22、行定性和定量分析，这为我们明确某些细胞的电生理特性提供了基础。近年来，神经干细胞已成为一个研究热点，神经干细胞研究的目的就是应用它结构与功能可塑的特征来修复发生损伤或退行性病变的中枢神经系统。对正在分化的神经元细胞系的定性研究表明形态学的发育与功能的成熟并不是完全很好的相关。如果仅通过定性分析就假定神经干细胞来源的神经元和神经胶质细胞是充分分化和有功能的，而无电生理或其他功能性方面的研究证据，那么这种研究是很难令人信服的，因此，功能性的成熟尤为重要。我们对培养的新生大鼠海马干细胞分化的神经元的电生理特征进行了初步的探讨，结果证实：海马干细胞分化的神经元可表达瞬时外向钾电流（IA）；延迟整流钾电
23、流（IK）：钙电流（Ica);钠电流及NMDA受体电流，并可产生动作电位，这说明海马干细胞分化的神经元具有神经元的初步的电生理特征，但与原代培养的海马神经元相比无论是其各种通道表达的数量还是动作电位的特征均存在明显差别，表明其电生理特征尚不成熟。如何使其成为具有成熟电生理特征的神经元将是下一步研究的重点。,电压门控性离子通道的动力学特性研究:细胞正常功能的维持有赖于各种离子通道数量的平衡表达和功能的精细调节，离子通道存在激活门和失活门两个门，这就决定了离子通道存在激活、关闭和失活三种状态，对这三种状态的动力学过程的研究对揭示电压门控性离子通道的功能特点有重要意义，一些疾病或一些临床药物正是通过
24、对上述动力学过程的影响来发挥作用的。例如SO2是一种常见的全球性大气环境污染物，SO2代谢衍生物可剂量依赖性地增大钠电流,剂量为10和100mol/L时,钠电流分别增大50.5919.08%和82.0618.51%(n=15);此外还与电压呈依赖性关系,但不具有频率依赖性;10mol/L SO2代谢衍生物不影响钠电流的激活过程,却非常显著地影响其失活过程,作用前后的半数失活电压分别为-69.714.67和-53.274.95 mV(n=10,P0.01),但不改变失活曲线的斜率因子。实验结果提示,SO2衍生物具有类似神经毒物的作用。,突触联系、突触传递的研究：突触后电流是神经元之间是否形成突触
25、联系的特异性电生理指标。神经干细胞移植已成为修复损伤或退行性病变的中枢神经系统的新的治疗手段，移植的干细胞要发挥治疗作用最根本的是要能和其他的正常的神经元发生功能性的联系。通过突触素及电镜的观察表明，神经干细胞和原代培养神经元体外共培养，二者能发生形态上的突触连接，通过记录突触后电流，证实二者也能发生功能性的联系，至于干细胞体内移植，他和其他神经元能否发生功能性的突触连接有待进一步研究。,1.突触可塑、学习记忆及其机制的研究：长时程增强（LTP）是评价学习记忆的及其突触可塑的常用的电生理指标。目前，海马脑片离体实验己经广泛用于学习记忆方面的研究，利用膜片钳技术记录脑片LTP，可在细胞水平研究学
26、习记忆的机制。许多学者从不同方面对突触LTP与学习记忆的关系进行了大量的研究，其结果大致可概括为，一些影响LTP的因素确实对学习研究过程产生明显的影响，一些影响学习过程的因素也影响LTP形成。诱导海马脑区的LTP形成可提高学习记忆活动，学习过程中伴有海马脑区LTP的形成。丙戊酸钠是常用的抗癫痫药，但近年来发现其损伤患者的学习记忆功能。我们观察了丙戊酸钠对大鼠海马LTP的影响及其作用机制。初步表明丙戊酸钠对LTP的影响是通过突触前机制起作用。,疾病机制研究：离子通道结构和功能的异常可导致离子通道病，人类许多疾病都是由于各种离子通道的功能障碍所造成的，常常累及人体多个系统，目前已经发现至少有几十种
27、离子通道参与离子通道疾病的发生，根据病因，大致可分为几类：,（1）离子通道基因编码区突变，导致离子通道功能亢进或降低：如癫痫是由于患者脑组织病灶中的神经元同时去极化，产生高频、同步、爆发式放电并向周围扩散，导致更广泛的脑组织兴奋，引起癫痫发作。研究发现，高热惊厥癫痫综合症患者的第19号染色体上的基因发生了突变，而这个突变的基因正是电压依赖性钠通道1亚基的基因。1亚基调节通道的开关速率，突变导致亚基上的一个氨基酸发生了改变，使钠通道的开关速率变慢，神经元的去极化时间延长，钠依赖性动作电位不断形成引发癫痫。,（2）通道调节能力缺陷：如细胞内钙在淋巴细胞的增殖、分化、IL-2的分泌及受体的表达等方面
28、起作重要作用，淋巴细胞膜上K（Ca）通道对细胞内钙的调节起作重要作用，研究表明，K通道阻断剂阻断此通道后，淋巴细胞的分裂增殖及IL-2的合成明显受到抑制。K（Ca）开放引起大量K外流，使细胞膜超级化，对Ca离子内流的驱动力增大，使Cai增加，Cai又使K（Ca）通道活化，导致Cai增加。,（3）产生自身抗体：如重症肌无力，是一种神经肌肉终板部位突触后膜上AChR减少而出现传递障碍的自身免疫性疾病，有家族史，与遗传密切相关。骨骼肌细胞AChR通道出现抗体，导致AChR功能障碍，以骨骼肌的渐进性疲劳和延及全身的虚弱为特点。,（4）形成新的离子通道而产生疾病：如B淀粉样蛋白可在神经元膜上形成大的非选
29、择性离子通道，该通道可通透Ca离子，这可能是老年性痴呆疾病中神经原受损的原因之一。,药物筛选：美国FDA规定，有关抗心率失常药物的申报必须有膜片钳的相关实验数据，膜片钳已成为抗心率失常药物筛选的金标准。类抗心率失常药物的寻找是当前心血管药物研究的重要方向，其作用特点是抑制瞬时外向钾电流、内相整流钾电流等多种钾离子通道，使动作电位时程（APD）延长，减慢兴奋的传导，降低心肌细胞兴奋性，从而发挥短期抗心律失常作用。各种K通道被抑制均可使APD延长，要单独观察药物对某一种钾电流的作用，并与其他K电流的影响相区别，普通的电生理实验是难以实现的，在这方面膜片钳有其独特的优越性。,细胞的胞吐与胞吞功能测定
30、：几乎所有细胞的脂质双层膜其电容均为1F/cm2，因此通过测定膜电容可精确反映细胞表面积的变化。当分泌囊泡与细胞膜融合后，其囊泡膜会增加到细胞膜上而使细胞膜的表面积增大；而当分泌囊泡经胞饮作用从细胞膜上退出后，则会使细胞膜的表面积减少，因此通过对细胞膜电容的监测可以反映细胞的分泌活动及其机制，另外，膜融合产生的一过性电流也可记录到。,膜片钳在其他方面的应用：膜片钳技术是一个应用非常广泛的电生理技术，他不仅用来记录离子通道的电活动，膜片钳电极本身还有许多非电生理学方面的应用，他与其他生物学方法的结合应用目前已经非常普遍。,膜片钳和钙图像技术的联合应用：Ca2+是重要的信使物质，Ca2+的信使功能
31、是通过调控细胞内游离Ca2+浓度来实现的。Ca2+信号的产生和终止是细胞内Ca2+增减、波动的结果。因此测定细胞溶质中的Ca2+浓度是十分重要的。钙荧光指示剂法是目前应用最广泛的,也是较好的测定胞内Ca2+浓度的方法。目前常用孵育法将荧光指示剂如Fura-2/AM导入细胞。因为荧光指示剂被酯化后,很容易跨过质膜进入细胞内。在胞内,酯形式指示剂被非特异性酯酶水解,重新与Ca2+结合，在340nm 380nm 的荧光强度比值能够很好的反映Ca2+浓度。应用酯类的荧光物质负载进入细胞的方法尽管较为简便,但是,荧光染料会累积在胞内的酸性细胞器中(称为隔室效应),而不是与细胞胞浆内的游离Ca2+相结合,
32、因此会导致测量上的误差,且这种方法不适用于植物细胞，因为植物细胞的质膜存在非特异性酯酶，导致指示剂未进入胞内即被水解，利用膜片钳的全细胞技术，可将荧光探针直接导入细胞，从而避免隔室效应，也可通过膜片钳电极将细胞内的荧光探针抽吸稀释掉，从而测定细胞器（线粒体，内质网等）内的游离钙离子浓度。将膜片钳和钙图像技术联合应用可在测定细胞内游离Ca2+离子浓度的同时检测离子通道的功能改变。,膜片钳和激光共聚焦的联合应用：前面介绍的膜片钳和钙图像技术的联合应用测定细胞内钙只适用于单个的细胞，而利用这种方法测定脑片上单一神经元的离子浓度比较困难，原因在于在脑片上一个神经元的胞体和树突不在一个聚焦平面上，影响测
33、定浓度，激光共聚焦扫描显微镜大大减小了所测定细胞不同部位不在同一聚焦平面的误差，这对在脑片上细胞内离于浓度的测定更有意义。同时对在脑片上进行细胞形态研究更显优势。,与分子生物学的结合：膜片钳技术与分子生物学技术的联合运用已经非常广泛，分子生物学技术为离子通道的亚单位分子结构研究、基因的克隆、通道的表达等研究提供了有力的手段。通道、受体等的异源性表达：最常见的例子是通过向卵母细胞细胞内注射离子通道或受体的mRNA(或cDNA),使他们在卵母细胞中表达，然后研究其功能。或用基因突变技术改变氨基酸序列，改变蛋白质的性质，再用膜片钳研究其功能。单细胞基因表达的分析：采用全细胞记录技术将mRNA从细胞中
34、提出，对细胞的基因进行分析。它能对特定离子通道亚单位的mRNA与通道对电刺激、药物刺激所产生反应之间的关系进行研究。,膜片钳在检测神经递质释放中的应用：神经递质由突触前膜释放，并在突触传递中起作用。迄今为止，人们一直用生物化学的方法，如用高效液相色谱测量递质或代谢产物，或用放射性同位素标记测量。两种技术中，都需要用电极不断的进行刺激以使递质释放。用时间长和高频的电刺激，或伴随高钾溶液灌流。特别是后者，尤其偏离生理状态。另一方面，一个单一的，短暂的电刺激来刺激突触前纤维，以引起突触后的反应是电生理研究中常用的方法。然而，由这样一种刺激引起的神经递质释放是非常难以被记录的。膜片钳技术的发展，使这种
35、检测成为可能。外面向外式记录时，细胞膜上有受体-通道复合体，因此，有些研究者拿它作为一个感受器来检测细胞外门控，这种技术被称为膜片感受器（Patch Sensor）技术。例如，用肌肉膜的外面向外式膜片，上面有N型乙酰胆碱能受体-通道复合体，可以检测到纳摩尔浓度的乙酰胆碱。一些研究者已经用这种方法来研究了培养神经元的递质释放。Takehiko Maeda等更进一步发展了这种方法，在脑薄片应用这种“膜片感受器”技术获得成功。他们将脑片锥体神经元细胞膜上撕下外面向外式膜片后，将之置于脑片透明层上方3m，在71个脑片上，成功记录到了14次。膜片电流平均持续时间为28.38.1ms,电流幅度为10.83
36、.1 pA。这种膜片感受器技术有两个优点：其一，它允许检测由单个的、短暂的刺激引起的微量递质的释放；其二，它提供了高度的空间和时间分辨率，范围是微米级和毫秒级的。,膜片钳技术的发展：全自动膜片钳技术（Automated patch clamp technique）的出现标志着膜片钳技术已经发展到了一个崭新阶段，从这个意义上说，前面所讲的膜片钳技术我们称之为传统膜片钳技术（Traditional patch clamp technique），传统膜片钳技术每次只能记录一个细胞（或一对细胞），对实验人员来说是一项耗时耗力的工作，它不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选，也不适合需要记录大量
37、细胞的基础实验研究。全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题，它不仅通量高，一次能记录几个甚至几十个细胞，而且从找细胞、形成封接、破膜等整个实验操作实现了自动化，免除了这些操作的复杂与困难。这两个优点使得膜片钳技术的工作效率大大提高了！全自动膜片钳技术采用的标本必须是悬浮细胞，像脑片这类标本无法采用。此外，全自动膜片钳技术只能进行全细胞记录模式、穿孔膜片钳记录模式以及细胞贴附式单通道记录模式，而不能进行其他模式的记录。不同的全自动膜片钳技术所采用的原理也不完全相同，大体上有如下几种：,1.Flip-Tip翻转技术：将一定密度的细胞悬液灌注在玻璃电极中，下降到电极尖端的单个细胞通过在电极
38、外施加负压可以与玻璃电极尖端形成稳定的高阻封接，打破露在玻璃电极尖端开口外的细胞膜就形成了全细胞记录模式。德国Flyion公司的Flyscreen 8500系统采用的就是这一技术，其通量最高为6，即一次可同时记录6个细胞。它的显著特点是：（1）仍然采用玻璃毛坯作为电极；（2）药物施加微量、快速。,2.SealChip技术：完全摒弃了玻璃电极，而是采用SealChip平面电极芯片，一定密度的细胞悬液灌注在芯片上面，随机下降到芯片上约1-2m的孔上并在自动负压的吸引下形成高阻封接，打破孔下面的细胞膜形成全细胞记录模式。采用这一技术的美国Axon（MDS）公司的PatchXpress 7000A系统是高通量全自动膜片钳技术的典范，是离子通道药物研发的革命性工具，在国外实验室和制药厂广泛用于hERG通道药理学的研究。其通量最高为16，即一次可同时记录16个细胞。同时，其药物施加微量、快速，不仅用于药物筛选，还大量用于离子通道的基础研究,此外，同SealChip技术一样采用平面电极芯片，但只含有一个封接孔的小型全自动膜片钳设备也已经问世。这种小型设备代替了显微镜、防震台/屏蔽网和微操纵器，一次只记录一个细胞。虽然通量不高，但是由于封接破、膜等过程为自动化，工作效率也有显著提高。德国Nanion公司的Port-a-Patch就是这样的全自动膜片钳设备。,谢谢大家,
