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1、2023/8/17,1,医疗机构消毒效果监测,农垦嘉荫卫生监督所滕启宏 2010.8,2023/8/17,2,医疗机构消毒是预防院内感染的重要措施之一，消毒效果的监测是评价其消毒设备运转是否正常、消毒药剂是否有效、消毒方法是否合理、消毒效果是否达标的唯一手段，因而在医院消毒、灭菌工作中必不可少。医疗机构消毒效果监测时需遵循以下原则：监测人员需经过专业培训，掌握一定的消毒知识，熟悉消毒设备和药剂性能，具备熟练的检验技能；选择合理的采样时间(消毒后、使用前)；遵循严格的无菌操作。,2023/8/17,3,检测方法和判定标准：消毒技术规范2002年版。,2023/8/17,4,一、压力蒸汽灭菌效果监
2、测（1）化学监测法：1）化学指示卡(管)监测方法:将既能指示蒸汽温度，又能指示温度持续时间的化学指示管(卡)放入大包和难以消毒部位的物品包中央，经一个灭菌周期后，取出指示管(卡)，根据其颜色及性状的改变判断是否达到灭菌条件。2）化学指示胶带监测法:将化学指示胶带粘贴于每一待灭菌物品包外，经一个灭菌周期后，观察其颜色的改变，以指示是否经过灭菌处理3）对预真空和脉动真空压力蒸汽灭菌，每日进行一次B-D试验。4）结果判定:检测时，所放置的指示管(卡)、胶带的性状或颜色均变至规定的条件，判为灭菌合格；若其中之一未达到规定的条件，则灭菌过程不合格。5）注意事项:监测所用化学指示物须经卫生部批准，并在有效
3、期内使用。（2）生物监测法（略）,2023/8/17,5,二、紫外线消毒效果的监测 紫外线灯管辐照度值的测定（1）检测方法:紫外线辐照计测定法：开启紫外线灯 5min 后，将测定波长为 253.7nm 的紫外线辐照计探头置于被检紫外线灯下垂直距离 1m 的中央处，待仪表稳定后，所示数据即为该紫外线灯管的辐照度值。,2023/8/17,6,（2）结果判定:普通 30w 直管型紫外线灯，新灯辐照强度 90W/cm2为合格；使用中紫外线灯辐照强度70W/cm2 为合格；30W 高强度紫外线新灯的辐照强度180W/cm2 为合格。（3）注意事项:测定时电压 220VV，温度 2025，相对湿度60，紫
4、外线辐照计必须在计量部门检定的有效期内使用；指示卡应获得卫生许可批件，并在有效期内使用。,2023/8/17,7,UV-2000紫外辐照度计,2023/8/17,8,三、手和皮肤黏膜消毒效果监测采样时间:在消毒后立即采样。采样方法：(1)手的采样:被检人五指并拢，用浸有含相应中和剂的无菌洗脱液的棉拭子在双手指屈面从指根到指端往返涂擦 2 次(一只手涂擦面积约 30cm2)，并随之转动采样棉拭子，剪去操作者手接触部位，将棉拭子投入 10ml 含相应中和剂的无菌洗脱液试管内，立即送检。(2)皮肤粘膜采样:用 5cm5cm 的标准灭菌规格板，放在被检皮肤处，用浸有含相应中和剂的无菌洗脱液的棉拭子 1
5、 支，在规格板内横竖往返均匀涂擦各 5 次，并随之转动棉拭子，剪去手接触部位后，将棉拭子投入 10ml 含相应中和剂的无菌洗脱液的试管内，立即送检。不规则的粘膜皮肤处可用棉拭子直接涂擦采样。,2023/8/17,9,2023/8/17,10,检测方法细菌总数检测:将采样管在混匀器上振荡20s或用力振打 80 次，用无菌吸管吸取 1.0ml 待检样品接种于灭菌平皿，每一样本接种2个平皿，内加入已溶化的 4548 的营养琼脂 15ml18ml，边倾注边摇匀，待琼脂凝固，置 361温箱培养 48h，计数菌落数。采样结果计算方法：细菌总数(cfu/cm2)（平板上菌落数 稀释 倍数）/采样面积(cm2
6、)致病菌检测：参考消毒技术规范3.17.15。,2023/8/17,11,2023/8/17,12,四、物品和环境表面消毒效果的监测采样时间:在消毒处理后进行采样。采样方法:用 5cm5cm 的标准灭菌规格板，放在被检物体表面，采样面积100cm2，连续采样 4 个，用浸有含相应中和剂的无菌洗脱液的棉拭子 1 支，在规格板内横竖往返均匀涂擦各 5 次，并随之转棉拭子，剪去手接触部位后，将棉拭子投入 10ml含相应中和剂的无菌洗脱液试管内，立即送检。门把手等不规则物体表面用棉拭子直接涂擦采样。,2023/8/17,13,2023/8/17,14,检测方法细菌总数检测:检测方法按手和皮肤黏膜消毒效
7、果监测执行。小型物体表面的结果计算，用 cfu/件表示。致病菌的检测：请参阅消毒技术规范2002版3.17.15。,2023/8/17,15,注意事项（1）送检时间不得超过 6h，若样品保存于 04，则不得超过24h。（2）被采样本表面积100cm2取全部表面；被采样本表面积100cm2，取 100cm2。（3）若消毒因子为化学消毒剂，采样液中应加入相应中和剂。,2023/8/17,16,结果判定、类区域：细菌总数5cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。类区域细菌：总数10cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。类区域细菌：总数15cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。母婴同室、早产
8、儿室、婴儿室、新生儿室及儿科病房的物体表面不得检出沙门菌。,2023/8/17,17,为什么使用中和剂？,中和剂：在微生物杀灭试验中，用以消除试验微生物与消毒剂的混悬液中和微生物表面上残留的消毒剂，使其失去对微生物抑制和杀灭作用的试剂。对消毒效果进行监测时，在抽样的同时会将连同残余消毒剂一起被采集到样品中并可能被携带到培养基或检验体系内，会对未被杀死的残存细菌生长产生影响，使得存活细菌检不出，导致消毒效果高于实际效果或灭菌效果出现假阴性。所以，在对消毒剂杀菌效果进行监测时，必须首先设法去除残余消毒剂，使残存细菌脱离其影响，获得正常的复苏生长条件，以便有效的检验。,2023/8/17,18,无菌
9、检验用洗脱液：吐温80 1g 蛋白胨 10g 氯化钠 8.5g 蒸馏水 1000ml将各成分加入到1000ml 0.03mol/LPBS液中，加热溶解后调PH至7.27.4，于121压力蒸汽灭菌20min备用。PBS即磷酸盐缓冲液。,2023/8/17,19,0.03mol/L PBS缓冲液：无水磷酸氢二钠 2.83g 磷酸二氢钾 1.36g 蒸馏水 加至 1000ml 将各成分加入到 1000ml 蒸馏水中，待完全溶解后，调 pH至 7.27.4；注意：去结晶水,2023/8/17,20,去结晶水问题,磷酸二氢（Na2HPO412H2O）,=,X=7.13g（每1000mL）,2023/8/
10、17,21,去结晶水问题,硫代硫酸钠（Na2S2O35H2O）,=,X=7.85g（每1000mL）,2023/8/17,22,含相应中和剂的洗脱液种类：1、卵磷脂 1g 吐温80 1g 无菌洗脱液 加至100ml此中和剂用于中和75%乙醇、氯已定、苯扎溴铵。2、卵磷脂 1g 吐温80 1g 甘氨酸 0.5g 无菌洗脱液 加至100ml此中和剂用于中和2%戊二醛。,2023/8/17,23,3、卵磷脂 1g 吐温80 1g 硫代硫酸钠 0.5g 无菌洗脱液 加至100ml此中和剂用于中和0.5%碘伏。4、卵磷脂 0.5g 吐温80 2g 硫代硫酸钠 0.5g 无菌洗脱液 加至100ml此中和剂
11、用于中和双链季铵盐消毒剂和其他复方消毒剂。,2023/8/17,24,5、吐温80 0.3g 硫代硫酸钠 0.5g 无菌洗脱液 加至100ml此中和剂用于中和单方含氯消毒剂和过氧化物消毒剂（如过氧乙酸、过氧化氢）。以上含相应中和剂的洗脱液都要调PH至7.27.4，于121压力蒸汽灭菌20min备用。保存条件和时间：4冰箱半年，常温一个月（出现混浊、结晶、长菌等应放弃）。,2023/8/17,25,五、空气消毒效果的监测采样时间:在消毒处理后、操作前进行采样。采样方法：平板暴露法(1)布点方法:室内面积30m2，设内、中、外对角线3点，内、外点布点部位距墙壁1m处；室内面积30m2，设 4 角及
12、中央 5 点，4 角的布点部位距墙壁 1m 处。(2)采样方法:将普通营养琼脂平板(直径为 9cm)放在室内各采样点处，采样高度为距地面 1.5m 采样时将平板盖打开，扣放于平板旁，暴露 5min，盖好立即送检。,2023/8/17,26,2023/8/17,27,检测方法：将送检的平板置37温箱培养48h，计数菌落数，并分离致病菌。平板暴露法结果计算公式：细菌总数（cfu/m3）=50000N/AT式中A为平板面积（cm2）；T为平板暴露时间（min）；N为平均菌落数（cfu）。注意事项采样前，关好门、窗，在无人走动的情况下，静止10min 进行采样。,公式说明,细菌总数（cfu/m3）=N
13、100/A5/T1000/10=50000N/AT这是个经验公式，是基于5分钟内在100cm2培养基上降落的细菌数相当于10升空气中含有的细菌数得出的。,2023/8/17,28,2023/8/17,29,结果判定类区域：细菌总数10cfu/m3(或0.2cfu/平板)，未检出金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌为消毒合格；类区域：细菌总数200cfu/m3(或4cfu/平板)，未检出金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌为消毒合格；类区域：细菌总数500cfu/m3(或10cfu/平板)，未检出金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌为消毒合格。,2023/8/17,30,撞击法：使用撞击式空气微生物采样器采样，由6层孔
14、径不一的撞击器组合成一体，采样时空气中的活性粒子通过各层筛孔由大至小有规律地分别撞击在各层平板上。不仅能测得空气中带菌粒子浓度，还能测出其大小分布情况；仪器组成：采样器（主体）、抽气泵、流量计及平皿等部件；选择采样器原则：捕获率高；性能稳定、使用方便、易消毒；噪声低；,2023/8/17,31,2023/8/17,32,六、消毒剂有效成分检测,一、戊二醛含量的测定试剂：1、6.5%三乙醇胺溶液。2、0.04%溴酚蓝乙醇溶液。3、盐酸羟胺中性溶液：17.5g盐酸羟胺加水75ml溶解，用异丙醇稀释至500ml，摇匀，加0.04%溴酚蓝乙醇溶液15ml，用6.5%三乙醇胺溶液滴定至溶液显蓝绿色（PH
15、4.2）。4、0.25mol/L硫酸标准溶液。,2023/8/17,33,操作：向250ml碘量瓶中精确加入戊二醛消毒剂10.0ml，精确加入6.5%三乙醇胺溶液20.0ml及盐酸羟胺中性溶液25ml，摇匀，静置反应1小时后，用0.25mol/L硫酸标准溶液滴定至溶液显蓝绿色（PH4.2），记录用去的硫酸溶液总量。同时，以不含戊二醛的三乙醇胺、盐酸羟胺中性溶液重复上述操作（空白对照），重复测3次，取均值进行以下计算。,2023/8/17,34,由于1mol/L硫酸标准溶液1ml相当于0.1001g戊二醛，故可按下式计算戊二醛含量：戊二醛含量 100%式中：C为硫酸标准溶液物质的量浓度（mol/
16、L）；V1和V2分别为空白和样品滴定中用去的硫酸标准溶液ml数；W为碘量瓶中戊二醛样品ml数）。,2023/8/17,35,二、有效碘含量的测定试剂：1、0.5%淀粉溶液。2、36%乙酸。3、0.1mol/L硫代硫酸钠标准溶液。,2023/8/17,36,操作：向100ml碘量瓶中精确加入含碘消毒剂5.0ml及36%乙酸1滴，用0.1mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定（通常用25ml滴定管，若预计有效碘含量大于5%时用50ml滴定管），边滴边摇匀，待溶液呈淡黄色时加入0.5%淀粉溶液10滴（溶液立即变蓝色），继续滴定至蓝色消失，记录用去的硫代硫酸钠溶液总量。重复测3次，取均值进行以下计算。,20
17、23/8/17,37,由于1mol/L硫代硫酸钠标准溶液1ml相当于0.1269g有效碘，故可按下式计算有效碘含量：有效碘含量 100%式中：C为硫代硫酸钠标准溶液物质的量浓度（mol/L）；V为滴定用去的硫代硫酸钠标准溶液ml数；W为碘量瓶中含碘消毒剂ml数）。,2023/8/17,38,三、过氧乙酸含量的测定试剂：1、0.5%淀粉溶液。2、10%碘化钾溶液。3、2mol/L硫酸标准溶液。4、0.01mol/L高锰酸钾溶液。5、10%硫酸锰溶液。6、3%钼酸铵溶液。7、0.05mol/L硫代硫酸钠标准溶液。,2023/8/17,39,操作：取1ml过氧乙酸样液于100ml容量瓶中用水稀释至刻
18、度，混匀。向100ml碘量瓶中加2.0mol/L硫酸5ml、10%硫酸锰3滴、过氧乙酸稀释液5ml，摇匀后用0.01mol/L高锰酸钾滴定至呈粉红色，随即加10%碘化钾10ml、3%钼酸铵3滴，摇匀并用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至淡黄色，加0.5%淀粉3滴（溶液立即变蓝色），继续用硫代硫酸钠滴定至蓝色消失，记录消耗的总量，重复3次取均值计算。,2023/8/17,40,由于1mol/L硫代硫酸钠标准溶液1ml相当于0.03803g过氧乙酸，故可按下式计算过氧乙酸含量：过氧乙酸含量 100%式中：C为硫代硫酸钠标准溶液物质的量浓度（mol/L）；V为滴定用去的硫代硫酸钠标准溶液ml数；W为
19、碘量瓶中所含消毒剂ml数。,2023/8/17,41,四、有效氯含量的测定试剂：1、0.5%淀粉溶液。2、10%碘化钾溶液。3、2mol/L硫酸标准溶液。4、0.1mol/L硫代硫酸钠标准溶液。,2023/8/17,42,操作：液体含氯消毒剂取1.0ml于100ml容量瓶中用水稀释至刻度，混匀。向100ml碘量瓶中加2.0mol/L硫酸10ml、10%碘化钾10ml、含氯消毒剂稀释液10.0ml。此时溶液出现棕色。盖上盖并振摇混匀后加水数滴于碘量瓶盖缘，置暗处5min。打开盖，让盖缘水流入瓶内。用0.1mol/L硫代硫酸钠（装于25ml滴定管中）滴定溶液呈淡黄色时，加0.5%淀粉10滴（溶液立
20、即变蓝色），继续用硫代硫酸钠滴定至蓝色消失，记录消耗的总量，重复3次取均值计算。,2023/8/17,43,由于1mol/L硫代硫酸钠标准溶液1ml相当于0.03545g有效氯，故可按下式计算有效氯含量：有效氯含量 100%式中：C为硫代硫酸钠标准溶液物质的量浓度（mol/L）；V为滴定用去的硫代硫酸钠标准溶液ml数；W为碘量瓶中所含消毒剂ml数。,2023/8/17,44,0.1000mol/L硫代硫酸钠标准溶液一、配制称取26g硫代硫酸钠(Na2S2O35H2O)，溶于1000ml纯水中，缓缓煮沸10min，冷却，保存于棕色瓶中，2周后进行标定。二、标定精确称取于120烘干至恒重的基准重铬
21、酸钾0.1500g,置于250ml碘量瓶中，溶于25ml水中，加2g碘化钾及20%硫酸溶液20ml，摇匀，密塞，在暗处放置10min后，加水150ml，用配制好的硫代硫酸钠溶液滴定至近终点时，加0.5%淀粉溶液3ml，继续滴定至蓝色消失而显亮绿色，同时做空白试验。,2023/8/17,45,C(Na2S2O35H2O)式中：C(Na2S2O35H2O)为硫代硫酸钠标准溶液的物质的量浓度（mol/L）；m为重铬酸钾的质量（g）；V1和V2分别标准和空白试验消耗的硫代硫酸钠标准溶液（ml）数。,2023/8/17,46,七、使用中消毒液染菌量测定,检测方法：1）涂抹法:用无菌吸管吸取消毒液 1.0
22、ml，加入 9.0ml 含有相应中和剂的采样管内混匀，用无菌吸管吸取上述溶液 0.2ml，滴于干燥普通琼脂平板，每份样品同时做2个平行样，一平板置 20 培养 7d，观察霉菌生长情况，另一个平板置35温箱培养 72h记数菌落数，同时按 3.17.15的原则检测致病菌。消毒液染菌量(cfu/ml)每个平板上的菌落50,2023/8/17,47,2）倾注法：用无菌吸管吸取消毒液 1.0ml，加入到 9.0ml 含相应中和剂的无菌生理盐水采样管中混匀，分别取 0.5ml 放入 2 只灭菌平皿内，加入已熔化的 4548 的营养琼脂 15ml18ml，边倾注边摇匀，待琼脂凝固，一平板置 20培养 7d，
23、观察霉菌生长情况;另一个平板置361培养 72h，计数菌落数，同时按 3.17.15的原则检测致病菌。消毒液染菌量(cfu/ml)每个平板上的菌落数 20结果判断:消毒液染菌量100cfu/ml，并未检出致病菌为合格。注意事项:采样后 1h 内检测。,2023/8/17,48,八、内镜消毒灭菌效果监测采样时间:在消毒灭菌后、使用前进行采样。采样方法:用沾有含相应中和剂的无菌生理盐水的棉拭子，在被检内镜上从镜头至镜身反复涂擦，剪去手接触部位，将棉拭子投入到 5ml 含相应中和剂的生理盐水采样管中，立即送检。,2023/8/17,49,检测方法(1)细菌总数的检测:按规范3.17.6.3.(1)执
24、行。(2)致病菌检测:将采样管在混匀器上振荡20s或用力振打 80 次，按规范3.17.15原则检测致病菌。结果判定:灭菌后内镜，未检出任何微生物为合格。消毒后的内镜，细菌总数20cfu/件，并未检出致病菌为合格。,2023/8/17,50,规范3.17.15 致病菌的检测,3.17.15.1 检测原则:致病菌的检测依据污染情况进行相应指标的检测。3.17.15.2 金黄色葡萄球菌检测。(1)增菌、分离取采样液 1ml，接种于 5ml SCDLP 液体培养基中，于361增菌 24h。取 1 白金耳上述增菌液，在血平板上作划线分离，361培养 24h。(2)观察菌落特征:在血琼脂平板上菌落形态为
25、金黄色、圆形凸起、表面光滑、周围有溶血圈。,2023/8/17,51,(3)镜检:挑取典型菌落作涂片染色镜检，镜下为革兰阳性、成葡萄状排列的球菌。(4)生化反应:取可疑菌落作触酶、葡萄糖发酵、血浆凝固酶、甘露醇发酵、新生霉素敏感试验，均为阳性者即为金黄色葡萄球菌。1）甘露醇发酵试验：取上述可疑菌落接种于甘露醇培养基，于361培养 24 h，发酵甘露醇产酸者为阳性。,2023/8/17,52,2）血浆凝固试验：玻片法：洁净玻片一端滴一滴灭菌生理盐水，另一端滴一滴血浆，用白金耳挑取菌落分别与生理盐水和血浆混匀，min 内观察有无固体颗粒状物，若血浆出现凝块，生理盐水均匀混浊为阳性，两者均混浊为阴性
26、。试管法：吸取 1:4新鲜血 0.5ml，放在灭菌小试管中，再加入等量待检菌 24h 肉汤培养物，混匀后放入361孵箱中，同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌肉汤培养物作对照，每 30s.观察一次，h 内出现凝块者为阳性。,2023/8/17,53,3.17.15.3 乙型溶血性链球菌检测(1)增菌、分离:取样品 1ml，接种于1葡萄糖肉汤，37增菌 24h。取 1 白金耳增菌液在血平板上作划线分离，361培养 24h。(2)观察菌落特征:菌落形态为灰白色、半透明或不透明、针尖状突起、表面光滑、边缘整齐、周围有溶血圈。(3)镜检:挑取典型菌落作涂片染色镜检，镜下为革兰阳性、呈链状排列的球菌。(4)
27、生化反应:取可疑菌落作如下生化试验，如触酶阴性、链激酶试验阳性、对杆菌肽敏感者，即为乙型溶血性链球菌。,2023/8/17,54,链激酶试验：吸取草酸钾血浆 0.2ml（0.02g 草酸钾加 5ml 人血浆混匀，经离心沉淀，吸取上清），加入 0.8ml 灭菌生理盐水混匀后再加入待检菌 24h 肉汤培养物 0.5ml和 0.25%氯化钙 0.25ml，混匀，放入361水浴中，每 min 观察一次（一般 10min内可凝固），待血浆凝固后继续观察并记录溶化的时间，如h 内不溶化，移入孵箱观察 24h 的结果，如全部溶化为阳性；24h 仍不溶解者为阴性。,2023/8/17,55,杆菌肽敏感试验：将被检菌浓菌液涂于血平板上，用灭菌镊子取含菌 0.04 单位杆菌肽纸片放在平板表面上。同时以已知阳性菌株作对照，于361 18h24h，有抑菌带者为阳性。3.17.15.4 沙门菌检测:参照 GB4789.4(食品中沙门菌检测方法)。3.17.16 试剂与培养基的配制：按附录A 进行。,2023/8/17,56,2023/8/17,57,谢谢,
