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1、第四节 目的基因表达产物检测与分离纯化,一、外源目的基因表达产物的检测 外源目的基因的表达包括转录和翻译两个阶段。外源基因表达产物的检测过程就是对特异性mRNA或蛋白质的检测。特异性mRNA的检测:Northern杂交 特异性蛋白质的检测:ELISA,Western杂交,1.Northern 印迹杂交(Northern blot),检测RNA（主要是mRNA）的方法 与Southern杂交的区别靶核酸：RNARNA电泳:在变性条件下进行,以去除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。变性电泳主要有3种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳。转膜：不需变性,2.ELISA,1
2、971年瑞典学者 Engvall 和Perlmann，荷兰学者Van Weeman和 Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA）。,ELISA原理,使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关,ELISA原理图,固相的抗原或
3、抗体（免疫吸附剂）,酶标记的抗原或抗体（标记物）,酶作用的底物（显色剂）,ELISA可以分为直接法、间接法和夹心法等几种。直接法：直接法是指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量。见图a间接法：是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结合形成复合物后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反应一抗和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量。见图b夹心法：是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，再用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物
4、；也可以象间接法一样应用酶标二抗和抗体-抗原-抗体复合物结合，形成抗体-抗原-抗体-酶标二抗复合物，见图C。前者称为直接夹心法，后者称为间接夹心法。,ELISA基本的实验过程,包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色,ELISA基本的实验过程,3.Western Blot 要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。Western blot 是生物学、生物化学、分子生
5、物学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。Western blot整个过程主要包括：PAGE电泳、转膜及蛋白检测3个阶段。,聚丙烯酰胺凝胶的组成及特点,组成：主要由丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉(亚甲基)双丙烯酰胺(Bis)聚合而成。聚合：单独或混合时稳定，出现自由基团时会聚合。化学法的引发剂：过硫酸铵（APS or AP)，催化剂：四甲基乙二胺（TEMED)特点：凝胶浓度越大，交联度越大，凝胶孔径越小。故根据分离蛋白质的大小选择不同浓度的凝胶。,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的原理,聚丙烯酰胺凝胶的特点,优点：聚丙烯酰胺凝胶电泳具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备
6、简单、用样量少(1100g)和分辨率高等优点。用途：蛋白质，核酸等物质的分离、定性和定量分析。,Western Blot 基本原理,经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测特定蛋白质的表达情况。,Western blot基本原理,Figure 1A.In the direct detection method,labeled primary antibody b
7、inds to antigen on the membrane and reacts with substrate,creating a detectable signal.1B.In the indirect detection method,unlabeled primary antibody binds to the antigen.Then,a labeled secondary antibody binds to the primary antibody and reacts with the substrate.,A.Direct Detection B.Indirect Dete
8、ction,Western Blot操作的过程,蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳,转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色,Gel electrophoresis,Tips:Separate proteins by gel electrophoresis 1-D gels 2-D gels,Transfer(Wet tank transfer system and Semi-dry transfer system),Blocking and Detection,Tips:one step and two steps,二、外源基因表达产物的分离纯化（一）细胞收集 1.离心法收集细胞 2.过滤法收
9、集细胞 3.絮凝法收集细胞,(二)细胞破碎 对于非分泌型表达的细胞，其表达产物需要先破碎细胞才可提纯。破碎方法有变性剂裂解法、超声波破碎法、机械破碎法、酶裂解法。,变性剂裂解法：SDS 超声波破碎法：将电能通过换能器转换为声能，这种能量通过液体介质(如水)而变成一个个密集的小气泡，这些小气泡迅速炸裂，产生的象小炸弹一样的能量，从而起到破碎细胞等物质的作用(俗称“空化效应”)。机械破碎法：液氮冻干细胞再研磨，高压匀浆器细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。酶裂解法：降解细胞壁。,(三)基因表达产物的粗分离1.离心分离2.蛋白质的盐溶和盐析3.透析和超滤4.凝胶过滤5.等电点沉淀6.有机溶剂提取7.萃取,(四)基因表达产物的柱层析粗分离1.装柱2.柱平衡3.上样4.洗脱5.样品收集,(五)基因表达产物的精细纯化1.电泳分离2.亲和层析3.高效液相色谱,
