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1、第14章分枝杆菌属第四军医大学徐志凯 教授,结核病是一种古老的疾病。从新石器时代人类的遗骨和古代木乃伊的骨关节的病理组织中，已发现人类在史前时代已患过结核病。中国医史中，结核病最早记载于内经并形容为“虚痨”之症。古代文献有提及肺痨为痨虫于肺所致，但未能确定致病的成因。,19世纪，结核病在欧洲和北美大肆流行，散布到社会的各个阶层，生活困顿的人群成了结核病的温床。而且是当时造成死亡的主要原因，被人们称为“巨大的白色瘟疫”。许多当年杰出的人物罹患结核病：雪莱、席勒、勃朗宁、梭罗等。结核病的流行甚至影响了诗人和艺术家的思想。,德国科学家Robert Koch在1882年发现了一种特殊的微生物结核杆菌，
2、结核病的致病细菌。他还证明了这种微生物是可以在培养基里培养出来的。这一发现使得结核的实验研究成为现实。,世界结核病防治现状,自发现MTB以来，全球约有两亿人死于TB，且疫情发展日趋严重。WHO已将TB作为重点控制的传染病之一，并于1995年起将每年的3月24日定为“世界防治结核病日”，以提醒公众加深对TB的认识。,据WHO预计，目前全球约20亿人已感染了MTB。全球现有TB病人2000万。TB的死亡将达历史最高水平，全球每天有8000人死于TB，每年约300万人死于TB。特别是在发展中国家，TB的形势尤其严峻，全球98的TB死亡和95的新发TB都是在发展中国家。,我国属于全球22个TB高负担国
3、家之一，TB的患病人数在世界各国中居于第2位。我国TB的流行具有“五多一高”的特点：MTB感染人数多。现患肺TB病人多。TB死亡人数多。耐药TB人多。农村TB人多。传染性肺TB患者疫情居高不下。,第一节 结核分枝杆菌,分枝杆菌属（Mycobacterium）是一类细长或稍弯的杆菌，因有分枝生长的趋势而得名。结核杆菌引起结核病。对人类致病的有人型结核杆菌和牛型结核杆菌。,1.形态与染色 结核杆菌细长略弯曲，端极钝园，大小约140.4 m，呈单个或分枝状排列，无荚膜、无鞭毛、无芽胞。在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型，可呈颗粒状、串珠状、短棒状、长丝形等。,一、生物学性状,抗酸染色（Ziehl-
4、Neelsen）显示痰标本中染为红色的特异性抗酸细菌（结核杆菌）。,其他非抗酸性细菌及细胞浆质等呈蓝色。结核杆菌的抗酸性取决于胞壁内所含分枝菌酸残基和胞壁固有层的完整性。,2.培养特性与生化反应,专性需氧菌营养要求高：在含有蛋黄、马铃薯、甘油和天门冬酰胺等的固体培养基上才能生长。最适pH为6.56.8，最适温度为37。生长缓慢：1824 h繁殖一代，接种后34周才出现肉眼可见的菌落。菌落为干燥、坚硬、表面呈颗粒状、乳酪色或黄色，形似菜花样。在液体培养基中呈粗糙皱纹状菌膜生长。不发酵糖类：与牛分枝杆菌的区别在于前者可合成烟酸和还原硝酸盐，而后者则不能。,结核杆菌培养的菌落,（1）脂质（Lipid
5、）：占菌体干重2040%，占胞壁干重60%，主要是磷脂、脂肪酸和蜡质，大多与蛋白质或多糖结合成复合物。,3.主要菌体成分及其作用,结核分枝杆菌无内毒素，也不产生外毒素和侵袭性酶类，其致病作用主要靠菌体成分，特别是胞壁中所含的大量脂质。脂质含量与结核分枝杆菌的毒力呈平行关系，含量愈高毒力愈强。,磷脂：能刺激单核细胞增生，并可抑制蛋白酶的分解作用，使病灶组织溶解不完全，形成结核结节和干酪样坏死。脂肪酸：在脂质中比重较大，与分枝杆菌抗酸性有关。其中6,6-双分枝菌酸海藻糖具有破坏细胞线粒体膜，毒害微粒体酶类，抑制中性粒细胞游走和吞噬，引起慢性肉芽肿的作用。具有该物质的结核杆菌毒株在液体培养基中能紧密
6、黏成索状，故称索状因子。,蜡质D：胞壁中的主要成分，是一种肽糖脂与分枝菌酸复合物，能引起迟发型超敏反应，并具有佐剂作用。硫酸脑苷脂和硫酸多酰基化海藻糖：存在于结核分枝杆菌毒株细胞壁中，能抑制吞噬细胞中的吞噬体与溶酶体融合，使结核分枝杆菌在细胞内存活。这类糖脂能结合中性红染料产生中性红反应，借此可鉴定结核分枝杆菌有无毒力。,（2）蛋白质 结核分枝杆菌菌体内含有多种蛋白质，其中重要的是结核菌素（tuberculin）。结核菌素与蜡质D结合，能引起较强的迟发型超敏反应。（3）多糖 多糖常与脂质结合存在于胞壁中，主要有半乳糖、甘露醇、阿拉伯糖等。多糖可使中性粒细胞增多，引起局部病灶细胞浸润。而多糖抗原
7、是阿拉伯甘露聚糖，是分枝杆菌发生凝聚反应的特异性表面抗原。（4）核酸 核糖体核糖核酸是本菌的免疫原之一，能刺激机体产生特异性细胞免疫。,近年发现结核分枝杆菌在细胞壁外尚有一层荚膜。一般因制片时遭受破坏而不易看到。若在制备电镜标本固定前用明胶处理，可防止荚膜脱水收缩，在电镜下可看到菌体外有一层较厚的透明区，即荚膜。,（5）荚膜,主要成分为多糖，部分脂质和蛋白质。荚膜对结核分枝杆菌有一定保护作用：与吞噬细胞表面补体受体3（CR3）结合，有助于结核杆菌在宿主细胞上的粘附与入侵；荚膜中有多种酶可降解宿主组织中的大分子物质，给入侵细菌提供繁殖所需的营养；防止宿主的有害物质进入结核分枝杆菌，甚至如小分子N
8、aOH也不易进入。,抵抗力较强：干痰中可存活68个月；在3HCl、6H2SO4或4NaOH溶液中能耐受30 min，因而常以酸碱处理严重污染的样本，杀死杂菌和消化粘稠物质，以提高检出率。,4.抵抗力,对湿热、紫外线、乙醇的抵抗力弱。在液体中加热6263 15 min或煮沸、直射日光下23 h、75%乙醇内数分钟即死亡。,5.变异性,对链霉素、利福平、异烟肼等抗结核药物较易产生耐药性，耐药性菌株常伴随活力和毒力减弱。菌落、毒力等也易发生变异。1908年Calmette和Gurin将有毒的牛分枝杆菌培养于含胆汁、甘油、马铃薯的培养基中，经230次传代，历时13年，使其毒力发生变异，成为对人无致病性
9、，而仍保持良好免疫原性的疫苗株，称为卡介苗（Bacillus Calmette-Gurin，BCG）。,结核分枝杆菌无内毒素，也不产生外毒素和侵袭性酶类，其致病作用可能与细菌在组织细胞内顽强增殖引起炎症反应，以及诱导机体产生迟发型超敏反应性损伤有关。结核分枝杆菌可通过呼吸道、消化道和破损的皮肤黏膜进入机体，侵犯多种组织器官，引起相应器官的结核病，以肺结核最为常见。,二、致病性与免疫性,1.原发感染 多见于儿童。随飞沫和尘埃通过呼吸道进入肺泡。细胞内寄生。原发灶内结核杆菌可经淋巴管扩散到肺门淋巴结。随着机体免疫力的建立，原发灶大多可纤维化和钙化而自愈。极少数免疫力低下者经淋巴、血流扩散至全身，导
10、致全身粟粒性结核或结核性脑膜炎。,（一）肺部感染,多见于成年人。大多为内源性感染，极少由外源性感染所致。由于机体已形成对结核分枝杆菌的特异性细胞免疫，对再次侵入的结核分枝杆菌有较强的局限能力，故继发感染的特点是病灶局限，一般不累及邻近的淋巴结，主要表现为慢性肉芽肿性炎症，形成结核结节，发生纤维化或干酪样坏死。病变常发生在肺尖部位。,（一）肺部感染,2.继发感染,（二）肺外感染,部分肺结核患者体内的结核分枝杆菌可经血液、淋巴液扩散侵入肺外组织器官，引起相应的脏器结核，如脑、肾、骨、关节、生殖器官等结核。艾滋病等免疫力极度低下者，严重时可造成全身播散性结核。痰菌被咽入消化道可引起肠结核、结核性腹膜
11、炎等。通过破损皮肤感染结核分枝杆菌可导致皮肤结核。近年有许多报道，肺外结核标本中结核分枝杆菌L型的检出率比较高，应引起足够重视。,（三）免疫性与超敏反应,人类对结核分枝杆菌的感染率很高，但发病率却较低，表明人体对结核分枝杆菌有较强的免疫力。机体感染结核分枝杆菌后，虽能产生多种抗菌体蛋白的抗体，但这些抗体仅对细胞外的细菌具有一定作用，而对细胞内细菌不起作用。结核分枝杆菌的免疫性与致病性均与结核分枝杆菌感染后诱发机体产生的由T淋巴细胞介导的两种免疫应答反应相关，即细胞免疫和迟发型超敏反应。,1.免疫性,抗结核免疫力的持久性依赖于结核分枝杆菌在机体内的存活，一旦体内结核分枝杆菌消亡，抗结核免疫力也随
12、之消失，这种免疫称为有菌免疫或传染性免疫。抗结核免疫主要是细胞免疫，包括致敏T淋巴细胞和M。致敏T淋巴细胞可杀死有结核杆菌的靶细胞，同时释放多种淋巴因子（如TNF-、IFN-、IL-2、IL-6等），吸引NK、T、M等聚集炎症部位，还能增强这类细胞的直接或间接杀菌活性。激活的M极大地增强对结核分枝杆菌的吞噬消化、抑制繁殖、阻止扩散甚至彻底消灭的能力，充分发挥细胞免疫的作用。,（三）免疫性与超敏反应,2.超敏反应,机体获得对结核杆菌免疫力的同时，结核分枝杆菌的蛋白质与蜡质D共同刺激T淋巴细胞，形成迟发型超敏反应状态。体内致敏的T淋巴细胞再次遇到结核分枝杆菌时，即释放出淋巴因子，引起强烈的迟发型超
13、敏反应，形成以单核细胞浸润为主的炎症反应，容易发生干酷样坏死，甚至液化形成空洞。,（三）免疫性与超敏反应,儿童结核病大多为初次感染，机体尚未建立免疫和超敏反应，可发生急性全身粟粒性结核和结核性脑膜炎。成年人结核大多为复发或再次感染，此时机体已建立了抗结核分枝杆菌的免疫和超敏反应性，病症常为慢性局限性结核，不引起全身粟粒性结核和结核性脑膜炎，但局部病症较重，形成结核结节，发生纤维化或干酪样坏死。,2.超敏反应,3.结核菌素试验,将一定量结核菌素注入皮内，如受试者曾感染结核杆菌，则在注射部位出现迟发型超敏反应炎症，判为阳性，未感染者则为阴性。此法可用于检测可疑患者曾否感染过结核菌、接种卡介苗后是否
14、阳转以及检测机体细胞免疫功能。,结核菌素试剂有两种：旧结核菌素（old tuberculin，OT）：含结核分枝杆菌的甘油肉汤培养物加热过滤液，主要成分是结核蛋白，也含细菌的其他代谢产物和培养基成分。纯蛋白衍生物（purified protein derivative,PPD）：OT经三氯醋酸沉淀后的纯化物。,3.结核菌素试验,方法：目前多用PPD法。取PPD-C和BCG-PPD各5单位分别注入两前臂皮内，4872 h后，红肿硬结小于5 mm者为阴性反应；超过5 mm者为阳性；15 mm为强阳性。,结果分析：阳性反应表明机体已感染过结核枝杆菌或卡介苗接种成功，对结核杆菌有迟发型超敏反应，说明有
15、特异性免疫力。强阳性反应则表明可能有活动性结核病，尤其是婴儿。阴性反应表明未感染过结核分枝杆菌或未接种过卡介苗。原发感染早期、正患严重结核病或其他严重疾病致细胞免疫功能低下者（如用过免疫抑制者）也可能出现阴性反应。,3.结核菌素试验,应用：诊断婴幼儿的结核病；测定接种卡介苗后免疫效果；在未接种卡介苗的人群作结核分枝杆菌感染的流行病学调查；用于测定肿瘤患者的细胞免疫功能。,3.结核菌素试验,根据结核分枝杆菌感染的类型，应采取病灶部位的适当样本。如肺结核取咳痰（最好取第一次晨痰，挑带血或脓痰）；肾或膀胱结核以无菌导尿或取中段尿液；肠结核取粪便；结核性脑膜炎取脑脊液；脓胸、肋膜炎、腹膜炎或骨髓结核等
16、则穿刺取脓汁。,1直接涂片染色 咳痰、无菌采取的脑脊液、导尿或中段尿。抗酸染色法2分离培养3动物试验：豚鼠或地鼠4结核分枝杆菌核酸及抗体检测：PCR，ELISA,三、微生物学检查法,预防：接种卡介苗能极大降低结核病发病率。婴儿出生后即接种，较大儿童须做结核菌素试验，阴性者接种。接种后68周结核菌素试验即可阳性，阳转率可达9699%，表示接种者已有免疫力。阳性反应可维持约5年。治疗：早期、联合、足量、规范使用抗结核药物。常用药物有异烟肼、利福平、链霉素、对氨水杨酸、乙胺丁醇等。,四、防治原则,第二节 麻风分枝杆菌,麻风分枝杆菌可引起麻风病。该病是一种慢性传染病，世界各地均有流行。病菌可侵犯皮肤、
17、黏膜和外周神经组织，晚期可侵入深部组织和脏器，形成肉芽肿。从1985年以来，麻风病在全球的流行已降低90%。1985年全球有122个国家呈地方流行，到2003年已减少至10个，集中在非、亚和拉丁美洲，高发国家为印度、尼泊尔和巴西。该病在我国仅剩二百余例。,形态上酷似结核分枝杆菌，亦表现明显的抗酸染色特性，常在患者破溃皮肤渗出液的细胞中发现，呈束状排列。该菌是典型的胞内寄生菌，某些类型患者的渗出物标本中可见大量麻风分枝杆菌存在的感染细胞，这种细胞的胞质呈泡沫状，称为泡沫细胞或麻风细胞，这是与结核分枝杆菌感染的一个主要区别。麻风分枝杆菌是至今唯一不能人工培养的细菌。以麻风分枝杆菌感染小鼠足垫或接种
18、至犰狳可引起动物的进行性麻风感染，是研究麻风病的主要动物模型。,一、生物学性状,麻风分枝杆菌抗酸染色,自然状态下麻风分枝杆菌只侵害人，细菌由患者鼻分泌物及其他分泌物、精液或阴道分泌液中排出，故主要通过呼吸道、破损皮肤和密切接触等方式传播，家庭内传播多见。流行地区人群多为隐性感染，幼年最敏感。潜伏期长，平均25年，长者可达数十年。发病缓慢，病程长，迁延不愈。根据临床表现、免疫病理变化、细菌检查等可将大部分患者分为瘤型麻风和结核样型麻风；介于两型之间的少数患者又可再分为两类：界限类与未定类，两类可向两型转化。,二、致病性与免疫性,1.涂片染色镜检 患者鼻黏膜或皮肤病变处取刮取物做涂片，抗酸染色法检
19、查有无排列成束的抗酸杆菌存在。一般瘤型和界限类患者标本在细胞内找到抗酸染 色阳性杆菌有诊断意义，而结核样型患者标本中 则很难找到抗酸阳性杆菌。也可以用金胺染色荧 光显微镜检查以提高阳性率。病理活检也是较好 的诊断方法。2.麻风菌素试验 应用原理和结核菌素试验相同。麻风菌素常由麻风结节病变组织制备。此试 验在诊断上意义不大。,三、微生物学检查法,预防：主要依靠早期发现、早期隔离及早期治疗患者，特别对密切接触者要做定期检查。目前尚无特异性的疫苗。治疗：麻风药物主要是砜类，如氨苯砜、苯丙砜、醋氨苯砜等。利福平也有较强的抗麻风分枝杆菌作用。为防止耐药性产生应采用多种药联合治疗。,四、防治原则,思考题,1.试述结核杆菌的染色、培养、致病物质及感染特点。2.何谓结核菌素试验？解释其原理与应用。,参考阅读,Yves L.Janin.Antituberculosis drugs:Ten years of research.Bioorganic 112(1-2):24-37,
