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1、现代色谱分离技术,中国海洋大学医药学院海洋药物教育部重点实验室李国强 For 博兴京博控股股份有限公司2011-12-20,主要内容,高效液相色谱（HPLC）,3,一 薄 层 色 谱,引 言,薄层色谱(Thin Layer Chromato-graphy)，又称薄层层析，常用TLC表示。将固定相在玻璃、金属或塑料等光洁的表面上均匀的铺成薄层，试样点在薄层的一端，流动相借毛细作用流经固定相，使被分离的物质展开。,固定相：吸附剂。流动相：展开剂。分离原理：吸附与解吸附。,薄层板,固定相：硅胶为使用最广泛的薄层材料。除此之外还有氧化铝、硅藻土等。常用薄层硅胶的特征：,薄层板的制备方法,湿法：平铺法和
2、涂铺法。,制备薄层色谱,定性薄层色谱,使用目的,薄层色谱分类,（一）定性薄层色谱,点 样,展 开,定位与显色,1 点样,样品溶解：用甲醇、氯仿、石油醚、丙酮等挥发性有机溶剂，最好选用与展开剂极性相似的溶剂。点样工具：玻璃毛细管，微量点样器。点样量：与薄层的厚度、吸附剂的种类、显色剂的灵敏度等因素有关，若因样品溶液太稀，可重复点样。点样位置：距底边约1-2cm的起始线上，点与点的距离为0.5-1cm。点样方式：定性分析-点状点样。（直径3-5mm的圆点）制备薄层-条状点样。,2 展开,石油醚环己烷四氯化碳苯氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇水乙酸,极性增强,展开剂选用原则,1 对所需组分有良好的溶解性
3、（相似相溶）。2 可使成分间分开。3 待测组分Rf在0.20.8之间。,应注意：a 展开剂不淹没样点。b 薄层板呈倾斜状。C 展开过程应在密闭容器中进行。d 展开剂前沿上升到一定高度时取出，尽快标出展开剂前沿位置，以便计算Rf值。,2 展开,展开后将溶剂吹干。常见的定位方法：,3 定位与显色,(二)制备薄层色谱（PTLC）,特点：1 较分析薄层样品液的浓度大。2 板较大，较厚（吸附剂用量多）3 点样多点成直线。,用于制备的薄层色谱。,样品的检测,有色物质直接观察斑点。荧光物质紫外灯下观察。如必须采用化学试剂显色时，可将薄层板的大部分用另一块玻璃板盖住，留出一条进行显色，将需要的部分作出记号。,
4、样品的收集,切割：用刮刀刮下带有样品的吸附剂。回收：将刮下的吸附剂装入玻璃柱中，用极性尽可能低的溶剂洗脱，丙酮和氯仿常用。,TLC的特点,方法简便易行,价格低廉；分析快速；检出灵敏度高；分离能力强；检测手段多样化；应用广泛；,二 柱 色 谱,柱色谱,(一)硅胶柱色谱,1 原理：根据物质在硅胶柱上的吸附力不同而分离。一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附。流动相流过时各组分以不同的速率向下移动，吸附弱的组分随着流动相移动在前面，吸附强的组分移动在后面，各种化合物在色谱柱中形成带状分布，实现化合物的分离。,2 准备工作：,2 色谱柱的选择,下端有活塞的玻璃柱 柱子大小视
5、分离样品的量而定,3 洗脱剂的选择,洗脱剂多一般由一元或二元溶剂按一定的比例配比组成，通过不同的配比调节溶剂系统的极性，较复杂成分常用梯度洗脱。初始洗脱剂配比的选择：薄层试验，使待分离组分的Rf值介于0.10.2之间的展开系统可选为柱色谱的洗脱剂。,3 操作步骤,加样,洗脱,检测,合并,装柱,将色谱柱洗净、干燥，底部塞一小块脱脂棉。（1）干装法：将硅胶通过小漏斗倒入柱内，应不间断地形成一细流慢慢加入柱内，同时用橡皮槌轻轻敲打色谱柱，使装填均匀。柱装填好后，打开下端活塞，从上端倒入洗脱剂冲柱，以排尽柱内空气，并保留一定液面。（2）湿装法：将硅胶加入适量最初使用的洗脱剂，超声搅拌，调成混悬液，打开
6、柱子下端活塞，徐徐将混悬液倒入柱子，使洗脱剂慢慢流出，带动硅胶缓慢沉于柱的下端。待加完吸附剂后，继续使洗脱剂流出，直到硅胶的沉降不再变动。注意整个操作过程要慢慢进行，不要将气泡压入硅胶中，而且要始终保持吸附剂上端有溶剂，切勿流干。最后在硅胶上面加少许棉花，将多余洗脱剂放出至上面保持有1cm高液面为止，关上活塞。,装柱,洗脱,检测,合并,加样,3 操作步骤,多采用干法加样（拌样法）：将样品用尽量少的易挥发溶剂溶解，加入样品约5倍量的硅胶拌匀，置空气中挥尽溶剂，或在旋转蒸发器里于适温下蒸干，研匀后均匀置于装好硅胶的柱顶，尽量使样品平整，并在柱顶放一块圆形滤纸。,装柱,加样,洗脱,检测,合并,3 操
7、作步骤,将通过TLC选择好的洗脱剂加入分液漏斗或者加液球中，使之不断缓慢加于样品之上，注意始终保持洗脱剂液面在硅胶之上，切勿流干。打开色谱柱下端活塞，控制流速，等份收集洗脱液，也可用自动收集器收集。通过上端加压或者下端减压可以提高洗脱速度，但是可能会降低塔板数影响分离效果。,装柱,加样,洗脱,检测,合并,3 操作步骤,每份洗脱液采用薄层色谱法检查。,装柱,加样,洗脱,检测,合并,3 操作步骤,成分相同（斑点相同）的洗脱液合并，回收溶剂。,（二）凝胶柱层析,1 原理,2 凝胶层析中常用的凝胶,琼脂糖凝胶,聚丙烯酰胺凝胶,葡聚糖凝胶（Sephadex）,3 凝胶柱的使用,羟丙基葡聚糖凝胶（Seph
8、adex LH-20）为干粉，装柱前量好柱体积，再根据凝胶的吸水量计算干重，称重后足量用有机溶剂（常用氯仿：甲醇=1：1）溶胀。,将层析柱垂直固定在铁架上，打开柱下口开关。将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面的水层与凝胶体积相等。用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内。此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成凝胶柱。当到达所需凝胶高度时，立即关闭下口，使凝胶完全沉降。,湿法上样：打开层析柱的下口开关，放出凝胶柱面上的多余溶液，使液面与凝胶表面相平齐。将样品加在凝胶表面，打开下口开关，控制流速，使样品慢慢渗入凝胶内。当慢慢渗入凝胶的样品溶液面与凝胶柱面相平齐时，
9、关闭下口，完成上样。然后在凝胶柱面上加一层（35cm）洗脱液，接上洗脱瓶准备洗脱。,控制流速，过快或过慢影响分离效果。流出液分步收集，分析、合并。,1 原理：大孔树脂为新型非离子型分子聚合物吸附剂，白色球形颗粒，每个颗粒都是由许多彼此间存在孔穴的微观小球组成，称之为“大孔”。,（三）大孔树脂柱色谱,大孔树脂色谱是以大孔树脂为吸附剂，利用其对不同成分的选择性吸附和筛选作用，通过选用适宜的吸附和解析条件以分离、提纯某一或某一类化合物的色谱。,可分为极性、中极性、非极性三大类，根据分离物质极性的大小，通过所选择的与之相适应的大孔树脂的选择性吸附而达到分离目的。,2 特点,理化性质稳定。分离性质优良。
10、溶剂用量小。可重复使用。对天然产物化学成分如皂苷、生物碱、黄酮及其他一些苷类成分都有一定的吸附作用，对色素吸附作用较强。,3 操作步骤,乙醇浸泡24h，充分溶胀湿法装柱，用乙醇洗至流出液加等量蒸馏水无白色浑浊 蒸馏水洗至无醇味且水液澄清。,将样品溶于少量水中，以一定的流速加到柱的上端进行吸附。上样液以澄清为好，上样前要配合一定的处理工作，如上样液的预先沉淀、滤过处理、PH调节，使部分杂质在处理过程中除去，以免堵塞树脂床或在洗脱中混入成品。,一般先用水洗，再用梯度递增的乙醇溶液进行洗脱，并控制洗脱液的用量与流速，使提取液由上而下通过树脂柱。收集、合并洗脱液，减压蒸馏，回收溶剂至干，低温真空干燥，
11、得精制产品。,95%乙醇洗脱至无色，再用2%盐酸浸泡，用水洗至中性，再用2%NaOH浸泡，再用水洗至中性。,(四)ODS反相柱层析,1填料:ODS(octadecyl bonded silica),十八烷基键合硅胶，是以硅胶为基质键合的C18填料,ODS适用于分离中等偏大的化合物。与HPLC不同，开放式ODS是将ODS装入玻璃柱内，不加压或者用加压泵加压。,2 操作步骤,将ODS用甲醇浸泡，具体装柱方法与硅胶柱相同。用甲醇装柱完成后，置换成起始流动相系统。,三 高效液相色谱,引 言,以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法。HPLC是以经典的液相柱色谱为基础，流动相改为高压输送，采用高效固定相及在
12、线检测等手段，发展而成的分离分析方法。该法具有分离效能高、分析速度快及仪器化等特点，因而称为高效液相色谱法。,（一）HPLC工作原理,检测过程是非破坏性的，经过检测的洗提液可以依次收集起来，制成纯品，供进一步化学定性和结构鉴定。,液相色谱柱分类,正相柱：以硅胶为填料。或者硅胶表面键合-CN,-NH2等官能团。反相柱：以硅胶为基质，在其表面键合碳十八（ODS）、碳八、碳四等官能团的非极性填料。,制备型HPLC,分析型HPLC,（二）HPLC分类,使用目的,分析HPLC与制备HPLC比较,（三）HPLC的使用,初步纯化,优化 色谱条件（分析HPLC）,制备(制备HPLC),未经预纯化的样品，尤其是天然产物，含有大量可能在填料表面不可逆吸附的组分，直接进样，可导致昂贵的填料很快失效。此外，大量的杂质降低对目标产物的分离度，因此限制了进样量和生产效率。因此，HPLC前利用薄层色谱、柱色谱等进行初步纯化很有必要。,常用流动相：甲醇：水(酸水)乙腈：水（酸水）常用色谱柱：C18，C8 半制备柱 波长：全波长分析，确定最优制备波长。目标：通过改变流动相的配比，在尽量短的时 间内，使目的组分的分离度达到1.5。,按用分析HPLC确定的色谱条件，逐渐增大进样量，通过监测检测谱图，依次收集洗提液，制成纯品。,YMC C18,100%甲醇,80%甲醇,60%甲醇,254nm,谢谢,
